Ультратруктурное исследование гепатоцитов при хроническом воздействии кадмия показало нарушения мембранотропного характера. На препаратах отмечались нарушения со стороны ядерного аппарата клеток, внутриклеточных органелл, межклеточных контактов, конфигурации микроворсинок гепатоцитов, а также желчных капилляров, способствующих развитию микроциркуляторных нарушений. О наблюдаемых в цитоплазме гепатоцитов признаках повреждения аппарата синтеза белков и выработки энергии, свидетельствуют: расширение и фрагментация цистерн ГЭР, в которых появлялись везикулярно расширенные участки, лишенные рибосом; снижение числа прикрепленных и свободных рибосом; набухание митохондрий с редукцией крист (рисунок 5). При сорбентной терапии наблюдается некоторое снижение структурных нарушений (рисунок 6). Отмечалась вариабельность плотности матрикса митохондрий, что указывает на различие их энергетического состояния, обусловленного интоксикацией, а в целом - о недостаточности энергообеспечения гепатоцитов. Наблюдалась картина «слияния» митохондрий. В этот процесс были вовлечены мембраны ГЭР, образующие структурно ассоциированные с митохондриями мито-ГЭР комплексы. Существует мнение, что эти образования нужны для транспорта специальных белков и, возможно, липидных компонентов из ГЭР в митохондрии [Meyer V.A., Meyer P.A., 1997]. В работах этих авторов установлено, что для синтеза цитохрома Р-450 необходимы тесные структурные связи митохондрий и ГЭР. По-видимому, такие ультраструктурные перестройки в паренхиматозных клетках печени связаны с метаболизмом токсиканта в клетках органа - мишени и необходимы для обеспечения окислительного гидроксилирования ксенобиотика монооксигеназной системой печени. Все указанные нарушения в гепатоцитах животных с дозой токсиканта в 3мг/кг м.т. были выражены больше.
Рисунок 5 - Ультраструктурные нарушения в гепатоцитах печени крысы, не получавшей коррекцию сорбентом, на 1сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3мг/кг м.т. Электронограмма. Ув.Ч10000
Рисунок 6 - Ультраструктурные нарушения в гепатоцитах печени крысы, получавшей таган-сорбент, на 1сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3мг/кг м.т. Электронограмма. Ув.Ч10000
Морфометрический анализ показал, что через 1 сутки, после окончания затравки, у животных объемная плотность ГЭР в гепатоцитах возрастала на 35% и 47%, соответственно дозе токсиканта в 1,5мг/кг и в 3мг/кг м.т. У животных с сорбентной терапией эти значения, относительно данных крыс без коррекции, уменьшались на 10% и 9%. Численная плотность прикрепленных рибосом в гепатоцитах уменьшалась через 1 сутки в 2,4 и в 2,7 раза, соответственно дозе хлорида кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м. т. У животных с сорбентом эти значения, относительно данных животных без лечения, возрастали - на 14% и 12% (рисунок 7). Число свободных рибосом, через 1сутки после интоксикации, уменьшалось: в 2,3 и в 2,5 раза (рисунок 8). У крыс, с коррекцией таган-сорбентом, число свободных рибосом, относительно данных у животных без лечения, возрастало: на 12% и 9%. Это свидетельствует о протективном влиянии данного сорбента даже в такой небольшой срок, как одни сутки. Все это указывает на значительное снижение белоксинтетической функции в печеночных клетках при кадмиевой интоксикации и протективную роль таган-сорбента на ультраструктуру гепатоцитов уже в первые сутки, после затравки.
Морфометрически признаки недостаточности энергообеспечения клеток проявлялись увеличением объемной плотности митохондрий: на 12% и 15%, соответственно дозе химиката в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т.
Рисунок 7 - Динамика изменениий числа прикрепленных рибосом в гепатоцитах печени крыс, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозах 1,5 мг/кг и 3 мг/кг м.т., а также коррекции таган-сорбентом
Рисунок 8 - Динамика изменений числа свободных рибосом в гепатоцитах печени крыс, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозах 1,5 мг/кг и 3 мг/кг м.т., а также коррекции таган-сорбентом
У животных с сорбентной терапией эти величины, относительно значений животных без коррекции, снижались: на 6% и 4%. В клетках печени крыс обеих групп отмечалось значительное снижение содержания гликогена: в 1,8 и в 2,1 раза, соответственно дозе хлорида кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. (рисунок 9). Значения объемной плотности гликогена у животных с таган-сорбентом повышались, относительно данных животных без лечения, на 19% и 18%. Через 1сутки, после кадмиевой интоксикации, многократно увеличивалась объемная плотность липидных включений: в 45 и 49 раз, соответственно дозе химиката в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. (рисунок 10). В цитоплазме отмечались липидные капли различных размеров, отдельные из которых находились в стадии резорбции. Все это свидетельствует о глубоком нарушении липидного обмена. Таган-сорбент, оказывая протективное воздействие, снижал уровень липидов, относительно данных животных без лечения, на 20% и 6%, соответственно дозе кадмия в 1,5мг/кг и в 3мг/кг м.т. Такое соотношение показателей свидетельствует о том, что при высоких дозах токсиканта коррекция сорбентом протекает медленнее и, что более глубокие нарушения при высоких дозах токсиканта труднее поддаются коррекции. Характерное для действия кадмия повышение содержания липидных включений и, наоборот, уменьшение уровня гликогена, свидетельствует о нарушении соотношения основных энергетических субстратов клетки, при кадмиевой интоксикации. Это указывает на энергетический дисбаланс в печеночной клетке при интоксикации кадмием.
Рисунок 9 - Динамика изменений объемной плотности гликогена в гепатоцитах печени крыс, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозах 1,5 мг/кг и 3 мг/кг м.т., а также коррекции таган-сорбентом
Рисунок 10 - Динамика изменений объемной плотности липидов в гепатоцитах печени крыс, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозах 1,5 мг/кг и 3 мг/кг м.т., а также коррекции таган-сорбентом
Компенсаторные изменения в гепатоцитах, после интоксикации, выражались в гиперплазии комплекса Гольджи, развитии агранулярного эндоплазматического ретикулума (АЭР), возрастании объемной плотности лизосом и пероксисом (рис. 11). У животных с коррекцией наблюдались аналогичные явления (рисунок 12).
Рисунок 11 - Компенсаторные изменения в гепатоцитах печени крысы, не получавшей сорбентную терапию, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3 мг/кг м.т. Электронограмма. Ув.Ч10000
Рисунок 12 - Компенсаторные изменения в гепатоцитах печени крысы, получавшей таган-сорбент, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3 мг/кг м.т. Электронограмма. Ув.Ч10000
Через 1сутки после интоксикации число лизосом у животных увеличивалось в 2,1 и в 2,3 раза, соответственно дозе хлорида кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. Это свидетельствует о том, что при интоксикации возрастают, в первую очередь, число вторичных активных лизосом. Такая ситуация способствует активации кислых гидролитических ферментов в лизосомах, осуществляющих процессы внутриклеточного переваривания. По данным некоторых исследователей [Yamazaki K., LaRusso N.F., 1999; Tjelle T.E., Lovdal T., Berg T., 2000], лизосомально- вакуолярный аппарат гепатоцитов, участвующий в процессах эндо-, экзо- и диацитоза, осуществляет связь метаболизма ксенобиотиков с внутренней средой. Этот механизм, считают авторы, запускает процесс реутилизации продуктов обмена в организме. Увеличение в гепатоцитах числа лизосом и пероксисом может быть обусловлено активацией расщепления липидных включений на жирные кислоты, использующихся в клетке в качестве источника энергии, при ее дефиците. Близкое расположение пероксисом к местам резорбции липидов может свидетельствовать об усилении расщепления липидных капель в силу участия этих органоидов в жировом обмене. Длительное воздействие токсиканта вызывает состояние временного энергетического дефицита, возникающего из-за недостатка гликогена, что, вероятно, компенсируется становлением резервного, альтернативного пути энергетического обмена, который и в митохондриях и в пероксисомах, базируется на усилении процессов бета-окисления жирных кислот [Gregory D., Vlahelvic L., Prugh M., Swell L., 1998]. Таким образом, таган-сорбент оказывал через 1 сутки протективное влияние на структурно-функциональную организацию всех структур тканевого микрорайона печени. Но сорбционные свойства препарата не проявлялись в полной мере при небольшом сроке его применения.
Через 7 суток, после затравки, в паренхиме печени животных были видны признаки развития компенсаторных процессов. Но, несмотря на это, структурные изменения сохранялись. Сохранялись отечность гепатоцитов, дистрофические изменения в них, связанные с вакуолизацией цитоплазмы, явления некробиоза и некроза отдельных клеток. У крыс с коррекцией наблюдалось снижение указанных нарушений. Ультраструктурно в гепатоцитах, вследствие развития компенсаторных процессов, наблюдалась тенденция к восстановлению белоксинтезирующей и энергообразующей функций клеток, о чем свидетельствовало уменьшение объемной плотности мембран ГЭР, возрастание числа рибосом, снижение отека в митохондриях. Так, морфометрически объемная плотность ГЭР снижалась, относительно показателей предыдущего срока, на 6% на 9%, соответственно дозе токсиканта в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. У животных с сорбентом объемная плотность ГЭР снижалась еще на 10% и 4%. Это доказывает то, что действие сорбента, при меньшей дозе хлористого кадмия в 1,5мг/кг м.т., более выражено. Число прикрепленных и свободных рибосом, у животных, получавших дозу хлорида кадмия в 1,5мг/кг м.т., повышалось, относительно предыдущего срока, на 30% и 40%, соответственно. У животных с коррекцией эти значения возрастали еще на 9% и 5%. У животных, получавших дозу хлорида кадмия в 3мг/кг м.т., число прикрепленных и свободных рибосом увеличилось через 7 суток на 45% и 23%. После коррекции эти значения далее повышались еще на 6% и 13%. Указанное свидетельствует о том, что глубина нарушений и степень воздействия таган-сорбента зависят от дозы токсиканта. На 7-е сутки отмечалось снижение уровня липидных включений и повышение содержания гликогена, особенно у животных с сорбентом. Катаболические процессы ослабевали, о чем свидетельствует уменьшение объемной плотности лизосом. Глубина изменений в органеллах гепатоцитов зависела от дозы кадмия: при интоксикации дозой химиката в 3мг/кг м.т. наблюдались более глубокие нарушения. Использование таган-сорбента в этот срок способствовало улучшению структурно-функциональной организации печени, снижению глубины указанных выше нарушений. Процессы восстановления были дозозависимы: при меньшей дозе хлористого кадмия в 1,5мг/кг м.т. они происходили более интенсивно. В отдаленные сроки - на 21 день после затравки, в паренхиме печени животных отмечались восстановительные явления, характеризовавшиеся снижением всех морфофункциональных нарушений. Но, несмотря на снижение нарушений под действием компенсаторно-приспособительных механизмов, изменения в некоторых структурах тканевого микрорайона печени сохранялись. В гепатоцитах многие нарушения восстанавливались лишь частично. Так, в клетках печени происходило частичное восстановление белоксинтетической и энергообразующей функций клеток. Число прикрепленных и свободных рибосом оставалось на довольно низком уровне, по сравнению с контрольными показателями. Так, число прикрепленных рибосом на 21 сутки, относительно показателей 7-х суток возрастало, но оставалось еще ниже контрольных значений на 40% и 41%, соответственно дозе хлорида кадмия в 1.5мг/кг и 3мг/кг м.т. Указанное свидетельствует о недостаточности функции синтеза белков на 21 сутки и говорит о глубоких повреждениях в печени при воздействием солей кадмия. После коррекции таган-сорбентом число прикрепленных рибосом поднималось еще на 12% и 10%. Количество свободных рибосом на 21 сутки эксперимента повышалось, по сравнению с данными 7-х суток, но оставалось ниже исходного уровня на 29% и 37%, соответственно дозе химиката в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. После коррекции число свободных рибосом у животных возрастало еще на 10% и 11%. Это свидетельствует о том, что полного восстановления числа рибосом на 21 сутки не происходит, что характеризует глубину нарушений.
Объемная плотность митохондрий, через 21 сутки после отравления, снижалась, но оставалась выше контроля на 4% и 6%, соответственно дозе токсиканта в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. Коррекция приближала данные величины к исходным значениям, снижая объемную плотность митохондрий еще на 4% в обеих группах. Показатели липидов на 21 сутки был выше контроля на 20% и 33%. Корреция сорбентом снижала их еще на 33% и 20%. Объемная плотность гликогена и липидов на 21 сутки не достигала контрольных значений и еще намного отличалась от показателей интактных животных. На 21 сутки уровень гликогена был ниже контрольных значений на 17% и 39%, соответственно дозе химиката. При сорбентной терапии содержание гликогена возрастало на 9% в обеих группах. Таким образом, 21 дневное использование сорбента оказывало после кадмиевой интоксикации значительное саногенное, протективное влияние на структурно-функциональную организацию тканевого микрорайона печени: гепатоцитов и его органоидов, структуру микроциркуляторного русла и интерстиция, снижая уровень всех указанных выше нарушений. Степень повреждений при интоксикации и процессы восстановления были дозозависимы. При воздействии таган-сорбента, показатели большинства органелл достигали контрольного уровня. Труднее поддавались восстановлению более глубокие нарушения, наблюдающиеся при двойной дозе хлористого кадмия в 3мг/кг м.т.
Полученные результаты подтверждают, что функциональная морфология гепатоцитов определяется состоянием синусоидальных клеток печени (эндотелиоцитов, печеночных макрофагов, липоцитов). Это позволяет рассматривать гепатоциты и синусоидальные клетки как единую кооперативную систему клеток. Численная плотность синусоидальных клеток в тестовой площади у животных после отравления существенно снижалась: на 22% и 32%, соответственно дозе токсиканта 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. Лечение таган-сорбентом, оказывая протективное воздействие, повышало у животных количество этих клеток на 8% и 17%, соответственно дозе химиката. В эндотелиоцитах (ЭЦ) и в печеночных макрофагах, при экзотоксикозе хлоридом кадмия в дозах 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т., происходили ультраструктурные нарушения мембранотропного характера, которые протекали синхронно с изменениями в гепатоцитах. Эти отклонения приводили, через 1 сутки после интоксикации, к нарушению белоксинтезирующей и энергообразующей функций синусоидальных клеток.
Ультраструктурно в эндотелиоцитах и в клетках Купфера отмечались однонаправленные нарушения в виде везикулярного расширения и фрагментации цистерн ГЭР. Морфометрические исследования показали возрастание объемной плотности ГЭР и снижение числа рибосом, что нарушало процессы синтеза белков. Так, в ЭЦ объемная плотность ГЭР возрастала через 1сутки на 19% - при дозе токсиканта 1,5мг/кг и на 41%- при дозе-3мг/кг м.т. Число прикрепленных рибосом в ЭЦ, при дозе хлористого кадмия 1,5мг/кг, уменьшалось в 2,1 раза, а при дозе химиката 3мг/кг м.т. - в 2,4 раза. При сорбентной терапии число прикрепленных рибосом возрастало на 36% и 30%. Число свободных рибосом также снижалось: 1,9 раза и в 2,2 раза, соответственно дозе кадмия. После коррекции их число повышалось на 6% и 8%. Нарушалась энергообеспеченность эндотелиальных клеток, о чем свидетельствует увеличение объемной плотности митохондрий, изменение плотности матрикса, редукция крист в некоторых из них. Митохондрии компоновались в блоки, мембраны ГЭР тесно прилегали к митохондриям. Объемная плотность митохондрий в ЭЦ через 1сутки возрастала на 16% и на 41%, соответственно дозе кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. Это говорит об отеке митохондрий и нарушении энергообеспечения эндотелиоцитов под действием хлорида кадмия. У животных, отравленных дозой 3мг/кг м.т., отек был выражен значительно. После коррекции объемная плотность митохондрий снижалась, по сравнению с данными животных без лечения, на 6% и 5%. Наблюдаемое просветление матрикса митохондрий с их вакуолизацией и фрагментация эндоплазматического ретикулума ЭЦ, считают некоторые авторы, сопряжено с нарушением структуры мембран и связанных с этим многочисленных функций и, прежде всего, регуляции обменных процессов через плазмолемму [Bedossa P.,1999; Волкова Е.С., 2002].