Автореферат: Структурная организация печени и ее регионарных лимфатических узлов при кадмиевой интоксикации и коррекции энтеросорбентом (анатомо-экспериментальное исследование)

- Полученные морфометрические и иммуноморфологические данные о нарушениях в структурах регионарных лимфатических узлов печени при кадмиевой интоксикации можно использовать в качестве эталонов для морфофункциональных исследований органов иммунной системы при различных экзо- и эндотоксических воздействиях на организм.

- Выявленное протекторное влияние таган-сорбента на структурную организацию печени при хронической кадмиевой интоксикации может быть использовано для выработки новых методов детоксикации организма и лечения токсических гепатитов, развивающихся при воздействии на организм различных химических веществ, для улучшения функционального состояния не только печени, но других органов и систем.

- Результаты проведенного исследования обосновывают возможности восстановления структурно-функциональной организации лимфатического региона печени при хронической интоксикации с помощью таган-сорбента, что является вкладом в развитие нового направления - восстановительной лимфологии.

- Полученные новые данные о нарушениях в ультраструктуре эндотелиоцитов обменных кровеносных капилляров лимфатических узлов печени при хронической интоксикации кадмием, а также изменения в них на фоне лечения таган-сорбентом позволяют оценить гемато-лимфатические отношения во всех органах иммунной системы в условиях экзотоксикоза и эндоэкологической реабилитации.

- Материалы диссертационной работы могут использоваться в учебном процессе медицинских вузов при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу клинической анатомии, гистологии, патологической анатомии и токсикологии.

Апробация практических результатов работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: - Республиканской научной конференции с международным участием «Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» (Алматы, 2002); международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2004); III Республиканской научной конференции с международным участием «Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» (Шымкент, 2005); I съезде лимфологов с международным участием 10-12 октября 2006 (Новосибирск, 2006); Республиканской научной конференции с международным участием «Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» (Шымкент, 2006); VIII Конгрессе международной ассоциации морфологов (Орел, 2006); научной конференции ««Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» в рамках международного конгресса «Медицинский университет на рубеже веков» (Алматы, 2006); международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008); YII международном симпозиуме, IX Чуйской научно-практической конференции «Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма (Чолпон-Ата, 2007); Евразийском симпозиуме «Проблемы саногенного и патогенного эффектов эндо- и экзоэкологического воздействия на внутреннюю среду организма» по вопросам фундаментальной и прикладной медицины, посвященном 80-летию академика РАМН Ю.И. Бородина (Чолпон-Ата,2009); международном симпозиуме «Современные проблемы лимфологии» (Алматы, 2009); V-ой Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» (Алматы, 2009).

Внедрение результатов работы. Результаты исследования структурно-функциональных нарушений в печени и ее регионарных лимфатических узлах при кадмиевой интоксикации, а также методов их коррекции таган-сорбентом внедрены: в лечебно-диагностическую деятельность терапевтического отделения городской клинической больницы №7 г. Алматы (17.05.2010г.), ГККП «Региональный Диагностический центр» г. Алматы (25.05.2010г.), Республиканского клинического госпиталя для ИОВ (17.06.2010г.), в практическую работу медицинского центра «Рада» г.Алматы (17.03.2010г.), в профилактическую и научную деятельность «Научного центра гигиены и эпидемиологии им. Х. Жуматова» (21.04.2010г.), а также в учебный процесс кафедр: гистологии (25.03. 2008г.), клинической анатомии и оперативной хирургии (07.04.2008г.), патологической анатомии с курсом судебной медицины (09.06.2008г.) Казахского Национального медицинского университета им. С.Д.Асфендиярова

1. Материал и методы исследования

В соответствии с научными задачами в эксперименте использовали 130 половозрелых крыс породы Вистар (самцов) в возрасте двух месяцев, массой тела 180-200г. Эксперимент состоял из 2-х серий опытов, где экспериментальных животных делили на 5 групп. Распределение животных по срокам исследования показано в таблице 1. Первая группа - интактные животные (контрольная группа), в течение 2,5 месяцев содержалась на стандартном рационе. Вторую группу животных содержали на рационе с добавлением хлорида кадмия в дозе 1,5мг/кг м. т., в течение 2,5 мес. Третьей группе животных, после окончания хронического экзотоксикоза хлоридом кадмия в дозе 1,5мг/кг м. т., в рацион добавляли таган-сорбент из расчета 1г/кг м. т., в течение 21 дня. Четвертую группу животных содержали на рационе с добавлением хлорида кадмия в дозе 3мг/кг м. т., в течение 2,5 мес. Пятой группе животных, после окончания хронического экзотоксикоза хлоридом кадмия в дозе 3мг/кг м. т., в рацион добавляли таган-сорбент из расчета 1г/кг массы тела, в течение 21 дня.

Таблица 1 - Распределение животных по срокам исследования

Животных выводили из опыта через 1, 7 и 21 сутки, после хронического экзотоксикоза и введения таган-сорбента, путем декапитации под эфирным наркозом. В качестве объекта исследований была использована печень и ее регионарные лимфатические узлы. Образцы печени для исследований брали из латерального края левой доли. Лимфоузел печени брали в печеночно-двенадцатиперстной связке, позади воротной вены.

У экспериментальных животных исследовали световые, полутонкие и ультратонкие срезы ткани печени и ее регионарных лимфоузлов. На каждый срок исследования использовали по 10 крыс. Для исследования ферментов забор проб крови у животных производился из брюшной аорты. В пробах исследовалось содержание аминотрансфераз (аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы) и общего билирубина в сыворотке крови.

На светооптическом уровне исследовали образцы печени и регионарных лимфоузлов. Из общегистологических методов применяли окраску гематоксилином Майера и эозином, метод окраски толудиновым синим и азур II-эозином. В световом микроскопе изучали полутонкие срезы, полученные с образцов печени и лимфоузлов. Для этого образцы органов фиксировали в 1% растворе OsO4 на фосфатном буфере (рН=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы, толщиной в 1мкм, окрашивали толуидиновым синим, монтировали на предметные стекла, заключали в канадский бальзам и изучали под световым микроскопом. Морфометрический анализ проводили с помощью светооптического микроскопа на полутонких срезах печени с помощью окулярной морфометрической сетки по методике Шкурупия В.А.(1989); согласно рекомендациям Автандилова Г.Г. (1990). Морфометрическая сетка была представлена тестовой системой, вмонтированной в окуляр микроскопа, состоявшей из 25 тестовых точек и 5 линий (площадью 6400 кв. мкм). Препараты изучали с использованием иммерсионного объектива при конечном увеличении в 1000 раз. Методом точечного счета при стандартном увеличении определяли объемную плотность цитоплазмы гепатоцитов, их ядер, просвета синусоидов. Также подсчитывали численную плотность гепатоцитов, двуядерных печеночных клеток, синусоидальных клеток.

Подвергали морфометрированию функциональные зоны регионарных печеночных лимфатических узлов на стандартной площади (1600 мкм2): краевой синус, первичные и вторичные лимфоидные узелки, паракортекс, мозговые тяжи, мозговые синусы.

Для ультраструктурных исследований из полутонких срезов препаратов печени, толщиной в 1мкм, выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы, толщиной 35-45 нм на ультратоме LKB-NOVA, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца [Reynolds E.S.1963] и затем изучали в электронных микроскопах JEM-7A, JEM-100S/SEG. Площади профилей клеток в пределах их плазматических мембран определяли с помощью открытой регулярной тестовой системы, при конечном увеличении негатива в 36 000 раз, расстояние между точками ( с учетом конечного увеличения) составляло 1,28 мкм. На каждом из этапов наблюдений измерениям подвергалось 15-30 профилей срезов гепатоцитов, эндотелиальных, клеток Купфера, липоцитов, а также эндотелиальных клеток кровеносных капилляров лимфатических узлов, что было обусловлено особенностями их численного представительства в органе. При этом соблюдался принцип равного количественного представительства клеток от каждого животного. Морфометрию объемной и поверхностной плотностей гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР), объемной плотности митохондрий, наружных и внутренних мембран митохондрий клеток печени, а также эндотелиоцитов обменных капилляров лимфоузлов проводили с помощью закрытой тестовой системы из квадратов с 378 узловыми точками, длиной тестовой линии 35мкм при конечном увеличении в 36000 раз. Численную плотность рибосом определяли в регулярно расположенных квадратных тестовых системах площадью 4,17мкм2, при конечном увеличении в 36000 раз. Объемную и поверхностную плотность лизосомальных структур, пероксисом, объемную и численную плотность липидных капель в липоцитах определяли с помощью закрытой тестовой системы из квадратов, площадью 25мкм2 из 378 узловых точек с длиной тестовой линии 35мкм при конечном увеличении в 36000 раз. Измерения проводили по рекомендациям Шкурупия В.А.(1989). Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Excel и Statistica. Для каждого значения определяли средние значения и доверительный интервал ( для Р ?99,9%). Межгрупповые значения определяли по t -критерию Стьюдента. Данные считались достоверными при Р< 0,05.

2. Результаты исследования и их обсуждение

печеночный кадмий сорбент

В результате исследования структурной организации печени при хронической интоксикации различными субтоксическими дозами хлористого кадмия (1,5мг/кг и 3мг/кг м.т.) получены следующие результаты: через 1 сутки после хронической интоксикации наблюдались существенные сдвиги системного характера, свидетельствующие о нарушениях во всех структурах тканевого микрорайона печени. В гепатоцитах всех исследуемых животных отмечали отек клеток, развитие вакуольной и жировой дистрофии. Многие гепатоциты, в основном, в перипортальной зоне находились в состоянии деструкции (рисунок 1). У животных, получавших таган-сорбент наблюдались аналогичные нарушения (рисунок 2). Явления некроза и некробиоза гепатоцитов у животных, получавших двойную дозу кадмия в 3мг/кг м.т. были более выражены (рисунок 3). Степень плотности цитоплазмы в различных гепатоцитах варьировала, но у большинства гепатоцитов цитоплазма просветлялась. При сорбентной терапии, вследствие непродолжительного времени воздействия, наблюдалась схожая картина (рисунок 4). Указанные нарушения приводили к снижению численной плотности гепатоцитов: на 16% и 18%, соответственно дозе хлорида кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. У животных отмечалась тенденция к снижению количества двуядерных гепатоцитов. В некоторых участках паренхимы наблюдалась клеточная инфильтрация, в которых встречались макрофаги, тучные клетки, эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты и плазмоциты.

Рисунок 1 - Структура печени крысы, не получавшей коррекцию сорбентом, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 1,5мг/кг м.т. Окраска толуидиновым синим. Ув.Ч 600

Рисунок 2 - Структура печени крысы, получавшей таган-сорбент, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 1,5мг/кг м.т. Окраска толуидиновым синим Ув.Ч 600

Рисунок 3 - Структура печени крысы, не получавшей сорбентную терапию, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3мг/кг м.т. Окраска толуидиновым синим. Ув.Ч 600

Рисунок 4 - Структура печени крысы, получавшей таган-сорбент, на 1-е сутки, после хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3мг/кг м.т. Окраска толуидиновым синим. Ув.Ч 600

Это являлось реакцией на некротические нарушения гепатоцитов. Вдоль портальных трактов наблюдали скопления клеток крови, преимущественно лимфоцитов. Отмечался отек периваскулярного пространства сосудов, истончение эндотелиальной выстилки, плазморрагии, извитости сосудов.

Синусоиды печени были расширены, в них наблюдался стаз эритроцитов, лимфоцитов и макрофагов, что суживало просвет синусоидов и нарушало кровоток. Наблюдалось чередование участков расширенных капилляров с ишемически спазмированными, что является свидетельством микроциркуляторных нарушений в печени под воздействием токсиканта. На препаратах отмечалось расширение интерстиция (перисинусоидального пространства Диссе), где наблюдалось скопление электронно-плотного вещества белкового происхождения, клеточного детрита (остатков разрушенных клеток), лимфоцитов, макрофагов. Это нарушало отток первичной лимфы, снижало интенсивность гемато-тканевого обмена, что вызывало в свою очередь ишемическое повреждение гепатоцитов. Все указанное приводило к снижению транспорта лимфы из печени, и как следствие, к развитию несбалансированного фиброза печени. Известно, что продукты распада гепатоцитов активизируют Т-лимфоциты, действующие через лимфокины на макрофаги, которые стимулируют развитие фибропластического процесса. В то же время, происходит и прямая стимуляция макрофагов продуктами окисления мембран разрушающихся клеток. Обращает на себя внимание появление в перисинусоидальном пространстве Диссе, в условиях кадмиевой интоксикации, В-лимфоцитов, трансформирующихся в плазматические клетки. Известно, что взаимодействие макрофагов и лимфоцитов - важный этап иммунного ответа организма. Изучение макрофагов и лимфоидных клеток в условиях антигенной стимуляции выявило, что активность макрофагов влияет на трансформацию лимфоцитов в плазматические клетки [Медуницин Н.В., 1999; Peterson T.C., Renton K.W., 2006]. Все указанные выше нарушения были более выражены у животных, получавших хлорид кадмия в дозе 3мг/кг м. т. Печень животных, которым после эксперимента добавляли в рацион таган-сорбент, через 1сутки имела почти сходное с описанным выше строение. Это говорит о недостаточности срока воздействия указанного сорбента и соответственно его протективного действия.

Морфометрический анализ препаратов печени выявил, что через 1 сутки после кадмиевой интоксикации, объем цитоплазмы возрастал, относительно контрольного значения: на 15% и на 20%, соответственно дозе токсиканта в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. Это свидетельствует об отеке печеночных клеток, развивающемся вследствие воздействия токсиканта. Причем отек клеток у животных, получавших дозу химиката в 3мг/кг м.т., был выражен больше. У животных с сорбентной терапией наблюдались аналогичные нарушения. Объемная плотность синусоидов, через 1 сутки после экзотоксикоза, увеличивалась, у животных в 1,6 и в 2,2 раза, соответственно дозе хлорида кадмия в 1,5мг/кг и 3мг/кг м.т. В то же время, у животных с таган-сорбентом эти значения, по сравнению с данными животных без коррекции, снижались на 10% и 8%.