Сравнительный анализ культурально-морфологических и ферментативных свойств yersinia enterocolitica и yersinia ruckeri
Н.А. Головачева, Л.И. Бычкова, А.В. Ткачев
Аннотация
Острые кишечные заболевания имеют широкое распространение, экономический ущерб от которых огромен. Бактериальные болезни - йерсиниозы привлекают широкий круг исследователей как за рубежом, так и в нашей стране. В последнее время все большее внимание уделяется изучению йерсиниозов, поскольку они все чаще вызывают болезни различных видов животных и имеют большое социальное значение. Нами проведен сравнительный анализ культурально-морфологических и ферментативных свойств Yersinia enterocolitica и Yersinia ruckeri.
Для исследования были отобраны 27 патогенных штаммов Y.enterocolitica и 5 штаммов Y.ruckeri. Y.enterocolitica были выделенные из различных объектов: проб фекалий от больных поросят, а также проб комбикормов, воды и воздуха фермерских помещений, а Y.ruckeri - от больной рыбы, имеющей клинические и патологоанатомические признаки, характерные для иерсиниозной инфекции. Анализ полученных результатов показал, что все изученные штаммы бактерий Y.enterocolitica и Y.ruckeri обладали одинаковыми культуральными, тинкториальными и биохимическими свойствами. Штаммы бактерий Y.ruckeri и Y.enterocolitica имели ряд схожих биохимических свойств и отличия в росте колоний при разных температурах инкубирования. При температуре 37°С бактерии Y.enterocolitica - были неподвижными или малоподвижными, а бактерии Y.ruckeri - неподвижными и в большинстве посевов не давали роста. Другой отличительной особенностью изученных штаммов бактерий Y.enterocolitica от Y.ruckeri была их способность разлагать мочевину и положительная реакция на каталазу, у штаммов Y.ruckeri - отсутствовала способность к утилизации сахарозы, сорбита, инозита, арабинозы и ксилозы. В дальнейших исследованиях планируем изучить эпизоотическую ситуацию по иерсиниозу в рыбных хозяйствах РФ и выявить неблагополучные зоны в отношении Y.ruckeri. Также планируем определить эффективность дезинфицирующих и антибактериальных средств в отношении возбудителя болезни Y.ruckeri.
Ключевые слова: Иерсиниоз, Yersinia enterocolitica, Yersinia ruckeri, культурально-морфологические свойства, тинкториальные, биохимические свойства. биохимический инкубирование иерсиниоз
Abstract
COMPARATIVE ANALYSIS OF CULTURAL, MORPHOLOGICAL AND ENZYMATIC PROPERTIES YERSINIA ENTEROCOLITICA AND YERSINIA RUCKERI
Acute intestinal diseases are widespread, the economic damage from which is enormous. Bacterial diseases - yersiniosis attract a wide range of researchers both abroad and in our country. Recently, more and more attention is paid to the study of yersiniosis, since they more and more often cause diseases of various animal species and are of great social importance. We carried out a comparative analysis of the cultural-morphological and enzymatic properties of Yersinia enterocolitica and Yersinia ruckeri. For the study, 27 pathogenic Y.enterocolitica strains and 5 Y.ruckeri strains were selected. Y.enterocolitica were isolated from various objects: fecal samples from sick piglets, as well as samples of compound feed, water and air from farm premises, and Y.ruckeri - from sick fish with clinical and pathological signs characteristic of yersiniosis infection. The analysis of the obtained results showed that all the studied strains of bacteria Y.enterocolitica and Y.ruckeri had the same cultural, tinctorial and biochemical properties. The bacterial strains Y.ruckeri and Y.enterocolitica had a number of similar biochemical properties and differences in the growth of colonies at different incubation temperatures. At a temperature of 37 °C, Y. enterocolitica bacteria were immobile or inactive, while Y.ruckeri bacteria were immobile and did not grow in most crops. Another distinctive feature of the studied strains of Y.enterocolitica bacteria from Y.ruckeri was their ability to decompose urea and a positive reaction to catalase, while Y.ruckeri strains lacked the ability to utilize sucrose, sorbitol, inositol, arabinose, and xylose. In further studies, we plan to study the epizootic situation of yersiniosis in fish farms in the Russian Federation and identify unfavorable areas in relation to Y.ruckeri. We also plan to determine the effectiveness of disinfectants and antibacterial agents against the pathogen Y.ruckeri.
Keywords: Yersiniosis, Yersinia enterocolitica, Yersinia ruckeri, cultural and morphological properties, enzymatic properties.
Введение
Острые кишечные заболевания имеют широкое распространение, экономический ущерб от которых огромен. Бактериальные болезни - йерсиниозы привлекают широкий круг исследователей как за рубежом, так и в нашей стране [1, 5, 13, 19, 20].
В последнее время все большее внимание уделяется изучению йерсиниозов, поскольку они все чаще вызывают болезни различных видов животных и имеют большое социальное значение [3].
В настоящее время установлена широкая циркуляция бактерий йерсиний среди сельскохозяйственных, домашних и диких животных, птице и рыбе, а также в окружающей среде и продуктах питания [10, 16, 21], что связано с их высокой адаптацией к сапрофитному образу жизни. Это особенность является одной из характерных биологических свойств данного вида микроорганизмов. Наряду с сапрофитными свойствами большое число штаммов иерси- ний проявляют и патогенные свойства в организме теплокровных животных за счет своей адгезивности, инвазивности, токсигенности, а также способности противостоять фагоцитозу.
Бактерии рода Yersinia составляют самостоятельную группу семейства Enterobacteri- aceae [14]. Кишечные йерсиниозы встречаются достаточно часто, однако их изучению уделяется мало внимания, что связано с трудоемкой диагностикой данных заболеваний [3, 10].
Род Yersinia включает 7 видов. Патогенными или условно-патогенными видами являются: Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Изучена антагонистическая активность йерсиний при межмикробных взаимодействиях [1].
Резервуаром возбудителя иерсиниозной инфекции, кроме больных животных и людей, могут быть и объекты окружающей среды - вода, растительные корма, почва, животные продукты, особенно молоко. Достаточно большую роль в распространении возбудителя иерсиниозной инфекции играют синантропные птицы и грызуны (серые крысы, мыши, голуби) ввиду того, что с их экскрементами возбудитель иерсиниоза часто попадает на овощи и фрукты в период хранения. Большой температурный диапазон (от +4 до +40°С) является благоприятным для размножения Y. enterocolitica, что способствует накоплению большого количества микробных клеток на объектах животноводческих помещений - стойл, подстилке, полов, овощехранилищах, навозной жиже и прочее [3].
Заболеванию особенно подвержен молодняк животных, что связано с нарушением зо- огигиенических, ветеринарно-санитарных, технологических, а также общих противоэпизоо- тических требований выращивания молодняка сельскохозяйственных животных.
Клиническая картина болезни характеризуется рядом специфических признаков, свойственным кишечным инфекциям, которые вызываются другими бактериями (Salmonella, Escherichia coli, Citrobacter и пр.). У больных животных наблюдается нарастающая слабость, учащенный пульс, учащенное и поверхностное дыхание, потеря аппетита, адинамия, понос, интоксикация, а затем и поражение центральной нервной системы, которое проявляется в виде судорог, а состояние депрессии чередуется с возбуждением. В дальнейшем может наблюдаться западание глазных яблок, обезвоживание организма и истощение. У некоторых животных могут быть конъюнктивит и артриты [3].
Для рыб патогенным видом является Y. ruckeri [17], которая характеризуется достаточно широким распространенением среди представителей флоры и фауны дальневосточных морей [12]. Возбудитель болезни вызывает гибель радужной форели [2], карпа, гибридов белого и пестрого толстолобика [7].
Кроме лососевых рыб возбудитель йерсиниоза выделяется также от сига, большеротого американского окуня, жирноголового гольяна, окуня, ленского осетра, раков и ондатр [2].
На сегодняшний день все большую популярность приобретают блюда из морепродуктов, например, суши и роллы. Для их приготовления, кроме риса, используется рыба и водоросли [9]. Результаты исследований Чистюлина Д.К. и соавторов [9] свидетельствуют, что в 30 % случаев антигены наружной мембраны Y. ruckeri присутствуют во внутренних органах рыб, моллюсков, ракообразных, а также на поверхности слоевища водорослей [12, 15].
Иерсиниозом подвержены разные виды лососевых и сиговых рыб. Y. ruckeri передается горизонтально, через воду и экскременты зараженной рыбы. Острое течение болезни чаще проявляется у мальков, а у более крупных рыб течение болезни имеет хронический характер.
Распространению иерсиниоза рыб способствует массовая и часто бесконтрольная перевозка рыбопосадочного материала [4].
Количество случаев заболеваний рыб иерсиниозом с каждым годом увеличивается, однако в список карантинных это заболевание не включено. Следовательно, иерсиниоз имеет тенденцию к повсеместному распространению в мире, что связано с развитием контактов между странами и ростом интенсивности аквакультуры внутри регионов [4]. Убыточность производства прудовой рыбы может быть связан не только с отсутствием создания экономической системы интеграции [8], но и с массовой гибелью рыб от инфекционных заболеваний [11, 18]. Поэтому возникает вопрос о необходимости своевременной диагностики заболевания и идентификации Y.ruckeri [4].
Йерсинии, выделенные от рыб, относятся к одному виду Y.ruckeri, исходные морфологические и культурально-биохимические свойства не имеют различий и не изменяются в условиях пассирования на искусственных питательных средах. Известны температурозависимые и психрофильные признаки Y.ruckeri, с активным размножением в диапазоне температур 2- 10°С, а также фактическим отсутствием подвижности и роста при температуре более 34°С [6].
По культуральным и морфологическим свойствам микроорганизмы рода Yersinia не отличаются друг от друга. Они отличаются только по биохимическим, серологическим, иммунологическим и патогенным свойствам [3, 5, 14].
Целью наших исследований было изучение и сравнение культурально-морфологических и биохимических свойств 2 видов бактерий Y^nterocolitica и Y.ruckeri.
Материал и методы исследования
Работа выполнялась в России на базе кафедры «Биологии и ихтиологии» МГУТУ им. К.Г. Разумовского (ПКУ) в 2020 году.
Для исследования были отобраны 27 патогенных штаммов Y.enterocolitica и 5 штаммов Y.ruckeri. Y.enterocolitica были выделенные из различных объектов: проб фекалий от больных поросят, а также проб комбикормов, воды и воздуха фермерских помещений, а Y.ruckeri - от больной рыбы, имеющей клинические и патологоанатомические признаки, характерные для иерсиниозной инфекции.
Культурально-морфологические свойства штаммов изучались методом высева на универсальные среды: мясопептонный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (МПА), дифференциально-диагностическую среду Эндо. Посевы инкубировали в термостате при температуре 25°С и 37°С в течение 24-48 часов [26-30].
Затем из молодых культур готовили мазки, окрашивали по методу Грама. Морфологические свойства бактерий изучали методом микроскопии. При этом обращали внимание на форму микробных клеток, характер их расположения, размер. Параллельно определяли чистоту культуры и изучали тинкториальные свойства (способность микроорганизмов окрашиваться анилиновыми красителями по методу Грама). Определение подвижности микробов изучали в препаратах раздавленная капля. Также изучали культуральные свойства на плотных и жидких питательных средах [26-30].
При изучении характера роста культур иерсиний на плотной питательной среде подробно описывали форму, величину, прозрачность, цвет, поверхность, рельеф, консистенцию, края и структуру колоний, выращенных на МПА. Бактерии каждого вида формировали колонии с определенными признаками.
При изучении характера роста культур иерсиний в жидкой питательной среде (МПБ) обращали внимание на степень помутнения, наличие либо отсутствие пленки на поверхности, наличие и характер осадка, цвет среды.
Биохимические свойства исследовали на средах Гисса, а также на Системах индикаторных бумажных (СИБ) (фирма «ИмБио», г. Нижний Новгород).
Антигенные свойства Y.enterocolitica и Y.ruckeri выявляли в реакции агглютинации на стекле с помощью серологического набора для диагностики кишечных иерсиниозов животных (ИЭКВМ, г. Харьков).
Результаты исследования и их обсуждение
Через 24 часа инкубации посевов при температуре 25°С на МПБ отмечен однотипный рост бактерий Y.enterocolitica и Y.ruckeri, который характеризовался легким помутнением с незначительным осадком в виде агглютината, а при взбалтывании образовывал равномерную муть. Через 48 часов наблюдалось обильное помутнение и более плотный осадок. На плотной среде МПА был отмечен рост мелких (0,21,0 мм), гладких, выпуклых, блестящих, прозрачных, с голубоватым оттенком колонии. При дальнейшей инкубации колонии увеличивались в размере (1,5-2 мм), становились шероховатыми. На среде Эндо через 24 часа вырастали мелкие (0,5-1 мм) лактозоотрицательные колонии. Они были гладкие, слегка выпуклые, прозрачные, бесцветные. Через 48 часов колонии увеличивались до 1,5-2 мм. Характерной особенностью Y.enterocolitica была характерная окраска - в центре колонии имели более темный красный цвет в виде точки, вокруг которой по периферии наблюдалась нежная розовато-голубоватая кайма. Инкубированные при 37°С штаммы иерсиний имели некоторые отличия от культур, выращенных при 25°С. Так, Y.enterocolitica и Y.ruckeri на МПБ давали обильное помутнение с образованием большого рыхлого осадка, который при встряхивании образовал равномерную муть. На среде МПА колонии были больших размеров, мутноватые. На среде Эндо через 24 часа колонии были также мелкие лактозоотрицательные, прозрачные, бледно-розовые, а не бесцветные в отличие инкубации бактерий при 25°С. Через 48 часов инкубации колонии бактерий также увеличивались, а у культур Y.enterocolitica в центре колоний появлялось темно-красное окрашивание в виде точки [3] (рис. 1).
Рис. 1 - Колонии Y. enterocolitica на среде Эндо
В мазках, окрашенных по Граму, выделенные бактерии исследуемых штаммов представляли собой грамотрицательные маленькие, короткие палочки (овоиды), которые располагались поодиночно, парами или небольшими скоплениями.
Инкубированные при температуре 25°С бактерии Y.enterocolitica и Y.ruckeri были подвижными, при температуре 37°С бактерии Y.ruckeri - неподвижными, Y.enterocolitica - неподвижными или малоподвижными.
Биохимические свойства культур изучали на средах Гисса, а также на Системах индикаторных бумажных (СИБ). Результаты исследований представлены в таблице. Как видно из данных, представленных в таблице, все культуры иерсиний ферментировали с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, декарбоксилировали орнитин и восстанавливали нитраты. В то же время культуры Y.enterocolitica и Y.ruckeri не разлагали лактозу, дульцит, раффинозу, рамнозу, салицин, не выделяли сероводород и индол, не дезаминировали фенилаланин, не обладали оксидазной и аргининдегидролазной активностью. Однако, отличительной особенностью Y.enterocolitica от Y.ruckeri была ее способность разлагать мочевину и положительная реакция на каталазу, у Y.ruckeri - отсутствовала способность к утилизации сахарозы, сорбита, инозита, арабинозы и ксилозы.