Автореферат: Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

Рис. 4 Изучение антигенной активности белка НК6 методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белком-антигеном НК6 и заблокированы нормальной сывороткой кролика в разведении 100 раз. Сыворотки больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала) и здоровых доноров раститровывали в серии разведений от 20 до 1280 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека).

Тест-система на основе белка GHF

В качестве формата проведения анализа был выбран вариант тИФА с непосредственной сорбцией рекомбинантного белка-антигена GHF на поверхность иммунологического планшета (Рис. 5). Препаратом для сравнения служил белок-антиген НК6.

а) б)

Рис. 5. Изучение антигенной активности белка GHF методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белками-антигенами GHF (a) и НК6 (б). Пулы сывороток крови больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала, Хантаан) и здоровых доноров использовали в разведении от 50 до 3200 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека). На графиках представлены реакции белков-антигенов с сыворотками крови больных ГЛПС (1) и с сыворотками крови здоровых доноров (2)

Тест-система типа «обратный сэндвич» на основе белка HT-LacZ в качестве визуализирующего антивидового конъюгата.

Ранее проведенный эксперимент по использованию в качестве антигена для выявления специфических антител человека к вирусу Добрава белка HK6 показало его принципиальную пригодность для решения этой задачи. Несомненно, в крови больных ГЛПС присутствуют антитела к пептиду HT. Однако, соотношение уровня неспецифического сигнала с нормальными антителами и специфического сигнала оказалось неблагоприятным и не позволило рекомендовать традиционно построенную систему непрямого тИФА на основе НК6 в качестве прототипа диагностикума для клинического применения. С целью повышения уровня специфичности реакции было принято решение заменить систему идентификации иммунных комплексов НК6 и специфических антител из сыворотки больных: взамен традиционного антивидового конъюгата против суммарных иммуноглобулинов человека в этом качестве был использован белок HT-LacZ. Принцип его использования основан на двух- или поливалентности антител любых классов. Таким образом, в составе иммунных комплексов всегда остаются незанятые антиген-связывающие центры антител, способные реагировать с антигеном, идентичным уже использованному. Реакционная способность этих центров нередко снижена из-за стерических ограничений, обусловленных низкой подвижностью главного шарнира иммуноглобулинов и их большими размерами. Однако, часть таких центров все же остаётся доступной для связывания. Очевидно, что структура и иммунохимические свойства пептида НТ в составе белков НК6 и НТ-LacZ идентичны, поэтому НТ-LacZ способен выявлять комплексы антител, сорбированных на подложке за счет связывания нанесенного НК6.

Рис. 6. Испытания системы «обратный сэндвич» с использованием белка HK6 в качестве антигена для активации планшета и белка HT-LacZ в качестве замены вторичных антител (антивидового конъюгата). А) связанные на подложке антитела визуализированы антивидовым конъюгатом против Ig человека; Б) связанные на подложке антитела визуализированы белком HT-LacZ

Полученные данные (Рис. 6) свидетельствуют о принципиальной возможности использования предлагаемой системы. Результаты с использованием белка HT-LacZ в качестве средства выявления иммунных комплексов полностью совпадали с аналогичными результатами, полученными при использовании традиционного антивидового конъюгата. Эти данные дополнительно подтвердили существование в сыворотке больных ГЛПС антител к пептиду НТ (шарнир на границе двух С-концевых доменов белка Gc). Однако, чувствительность и разрешающая способность системы «обратный сэндвич» оказалась недостаточной для её практического применения в клинической диагностике ГЛПС.

Оптимизация технологических свойств антигенов с помощью конструирования и скрининга банков делеционных производных.

Наряду с рациональным дизайном антигенов - производных белка Gc в рамках нашей работы был теоретически предложен и апробирован скрининговый метод решения той же задачи путём изготовления банка делеционных производных этого гена и отбора наиболее хорошо экспрессирующихся производных, среди которых затем методом иммуноскрининга отбираются иммунопозитивные варианты.

Ключевым элементом нового подхода к конструированию банка является использование ПЦР со случайной затравкой в качестве способа наработки необходимого количества материала для конструирования банка. Главной технической проблемой, успешно решенной в рамках эксперимента, является устранение принципиального ограничения метода ПЦР со случайной затравкой, заключающегося в способности случайной затравки образовывать в растворе дуплексы, самопроизвольно размножающиеся при проведении ПЦР в отсутствие специфической ДНК-матрицы.

На первой стадии конструирования банка in vitro были последовательно выполнены следующие операции:

(1) в случайные сайты целевого гена, находящегося в форме линейного фрагмента ДНК, внесли однонитевые разрывы с помощью ограниченного гидролиза панкреатической дезоксирибонуклеазой 1 (ДНКазой);

(2) провели расширение полученных брешей в сторону 5'-конца с помощью ДНК-полимеразы I E. coli в отсутствие дезоксирибонуклеотидтрифосфатов;

(3) провели отжиг на ДНК с брешами синтетических олигонуклеотидов, имеющих на 3'-конце 6-, 11-или 17-членную случайную последовательность, а на 5'-конце - константный участок (20 нуклеотидов). Константная часть предназначена для отжига адаптерного праймера («случайные» праймеры); ковалентно присоединили случайные праймеры, соединившиеся с ДНК-матрицей за счет комплементарных взаимодействий, путем лигирования ДНК-лигазой фага Т4;

(4) удалили избыток несвязанного с матричной ДНК случайного праймера путем батч-хроматографии на микропористом стеклянном сорбенте;

(5) провели реакцию ПЦР с адаптерным праймером («однопраймерная» ПЦР).

Для оптимизации концентрации реагентов, нуждающихся в точных стехиометрических соотношениях с целью подбора желательной средней длины фрагментов делеционных производных, были приготовлены серийные разведения панкреатической дезоксирибонуклеазы 1 и случайного праймера, продукты реакций, полученные в разных условиях, объединялись. Для отбора делеционных производных, пригодных для экспрессии in vivo, полученные in vitro фрагменты (очищенные продукты ПЦР) клонировали в вектор прямой селекции pQL30, содержащий ген ?-галактозидазы E. coli со встроенным полилинкером с мутацией смещения трансляционной рамки считывания. Встройка делеционных производных целевого гена в полилинкер с определенной вероятностью приводила к восстановлению рамки, что позволило визуально контролировать экспрессию белка в полученных клонах. Существенной особенностью предлагаемого метода является возможность отбора только тех фрагментов исходного гена, которые не только в силу восстановления непрерывности открытой рамки считывания, но и в силу своей последовательности, вторичной и третичной структуры кодируемого продукта обладают способностью к высокоэффективной экспрессии в бактериальных клетках.

Отработка методики конструирования и скрининга банков делеционных производных на примере неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С.

В качестве модельного объекта для отработки метода получения и скрининга банков делеционных производных был использован ген неструктурного белка NS5a вируса гепатита С серотипа 1b. В результате ручного отбора клонов, обладающих ?-галактозидазной активностью, по размеру было получено 37 клонов со вставками от 300 до 1000 п.н. Доля этих клонов среди всех синих колоний составила около 60%. Оставшиеся 40% приходились на клоны с микроскопическими вставками существенно менее 100 п.н. Клоны с размером вставок от 100 до 300 п.н. и более 1000 п.н. представлены не были. Таким образом, эффективность отбора вставок оптимального размера скрининговым методом оказалась достаточно высокой.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител сыворотки крови больных, инфицированных HCV генотипа 1b.

Поскольку мы считали наиболее удобным для иммунохимического применения растворимую форму белка, особое внимание при анализе банка было обращено на растворимость рекомбинантного продукта клонов. Было установлено, что активность ?-галактозидазы во фракциях клеточного лизата (растворимой и нерастворимой) сама по себе не является информативным параметром, характеризующим свойства клонов, так как чрезмерно зависит от условий культивирования. Напротив, информативным параметром оказалось отношение активности в водорастворимой и нерастворимой фракции. Именно максимизация этого параметра позволила отобрать клон с наивысшим уровнем продукции, получивший наименование S3. На Рис. 7 видно, что этот клон проявил максимальную реакционную способность с антителами от больных гепатитом С, отличную от уровня фона.

А)

Б)

Рис. 7. Характеристики клонов банка делеционных производных гена NS5a в векторе pQL30

А) Определение удельной активности LacZ (нормированной на объём фракции) в растворимой (темные столбцы) и нерастворимой (светлые столбцы) клеточных фракциях и их относительное соотношение. На оси ординат указана величина А620.

Б) Электрофоретический анализ (а-б) и вестерн-блоттинг (в) белков. Белки разделены в денатурирующем 15% ПААГ, с последующим окрашиванием сыворотками крови людей, инфицированных гепатитом С

Создание продуцентов антигенов на основе белка Gc вируса Пуумала с использованием метода конструирования и скрининга банков.

Отработанную на модельном объекте методику получения и скрининга банков делеционных производных применили для создания продуцентов укороченных производных поверхностного белка-антигена Gc хантавируса Пуумала K-27. кДНК целевого гена в форме линейного фрагмента длиной 1800 п.н. получали с помощью ПЦР с праймерами PUU2 и PUU4:

Из колоний с восстановленной активностью ?-галактозидазы была выделена плазмидная ДНК. Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором pQL30 выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами pQE-for и pUC(M13)for.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим Вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител пула высокоавидных сывороток крови больных, инфицированных вирусом Пуумала (2 пациента, переболевших в 2010 году); идентификация вида вируса проведена с использованием набора для МФА производства ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

Рис. 8. Положение делеционных производных гена Gс вируса Пуумала, представленных в клонах Puu-1 и Puu-2, на общей рестрикционной схеме М сегмента

Детекция целевого белка на мембране включала в себя: а) блокирование неспецифических связей путем инкубации мембраны с 1% BSA, б) взаимодействие с антителами, специфическими к целевому белку; в) взаимодействие с вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена; г) окрашивание с N,N'-диаминобензидином (ДАБ) в присутствии 1% пероксида водорода. После окрашивания с ДАБ наблюдают полосу, соответствующую расчетной массе белка (~114 кДа).

Из двух отобранных иммуноположительных клонов (Рис. 8) была выделена плазмидная ДНК.

Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором pQL30 выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами pQE-for и pUC(M13)for. Продукт ПЦР очищали с помощью Silica bead DNA gel extraction kit (MBI Fermentas) и использовали для автоматического секвенирования на капиллярном секвенаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer с помощью набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit.

Выводы

1. Впервые применен метод рационального дизайна для конструирования производных поверхностных антигенов хантавирусов, что позволило подтвердить теоретические предсказания доменной организации белка Gc, устранить его токсичность для бактериального продуцента и обеспечить фолдинг фрагментов in vivo.

2. Разработана оригинальная технология получения предложенного ранее пептидного антигена из состава белка Gc хантавируса Добрава, неспособного к автономному фолдингу. Показано существование в сыворотках крови больных ГЛПС антител, связывающихся с рекомбинантным пептидным антигеном.

3. Разработан новый метод конструирования и скрининга банков делеционных производных генов на модели белка NS5a вируса гепатита С, включающий оригинальную методику ПЦР со случайным праймером и скрининг in vivo с использованием нового вектора pQL30.

4. С использованием нового скринингового подхода получены делеционные производные гена Gc хантавируса Пуумала, пригодные для экспрессии в E. coli с образованием иммуноположительных продуктов.

5. Разработаны прототипы тест-систем с использованием рекомбинантных производных белка Gc хантавируса Добрава: слитых пептидных антигенов, в том числе, ферментативно меченных. Показана их способность выявлять специфические антитела в сыворотке больных.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова М.С., Баловнева М.В., Гусева М.А., Леонович О.А., Елагина Е.М., Папуниди К.Х., Ворович М.Ф., Терехина И.Л., Дзагурова Т.К., Шевелев А.Б. Метод определения остаточной ДНК клеток хозяина в вирусных препаратах вакцинного назначения с помощью ПЦР в реальном времен. Ветеринарный врач. 2010г. №5. Казань. С.45-48.