Автореферат
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
На правах рукописи
Смирнова Мария Сергеевна
Москва - 2013
Работа выполнена в отделе геморрагических лихорадок и поисковых исследований Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук (г. Москва).
Научные руководители:
Шевелев Алексей Борисович, доктор биологических наук
Дзагурова Тамара Казбековна, кандидат медицинских наук
Официальные оппоненты:
Лунин Владимир Глебович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России
Филатов Феликс Петрович, доктор биологических наук, главный консультант научно-клинического отдела вирусной диагностики ФГБУ ГНЦ «Гематологический научный центр МЗ РФ»
Ведущая организация:
ФГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ (г. Москва)
Защита состоится «___» ___________ 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская 42.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Вобликова В.Д.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
бактериальный мультиэпитопный синтетический белок
Актуальность темы.
Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что регуляции экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных генов. Еще реже удается добиться экспрессии in vivo полностью синтетических искусственных генов. Мы предполагаем, что трансляционные системы in vivo способны на стадии, предшествующей релизингу пептидил-тРНК, оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Пептидные цепи, не способные к этому, подвергаются немедленной деградации. В рамках этой гипотезы универсальным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции.
Проблемы с конструированием рекомбинантных продуцентов часто возникают при работе с мембранными белками и белками с большим числом дисульфидных связей. Эти проблемы особенно часто встречаются при попытках получения в гетерологичных системах вирусных антигенов, как структурных так и неструктурных. Помимо низкого уровня накопления белка сложность составляет высокая токсичность многих вирусных антигенов для клеток рекомбинантных продуцентов. По-видимому, эта особенность структурных и части неструктурных вирусных белков связана с наличием у них способности образовывать мультимолекулярные сети в составе вирусной частицы. Многоцентровые взаимодействия вирусных белков друг с другом и с элементами клетки хозяина при гетерологичной экспрессии способны вносить хаос в передачу сигналов внутри цитоплазмы и с участием мембран. Таким образом, универсальным подходом к снижению токсичности вирусных антигенов могло бы стать их расчленение на отдельные домены, не способные образовывать сети.
Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:
1. Предсказание доменной организации за счёт поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;
2. Разработка мультиэпитопных синтетических белков на основе иммунодоминантных пептидов, идентифицированных в структуре белка с помощью пептидного эпитопного картирования;
3. Скрининговый подход, основанный на конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с отбором из него делеционных производных, обладающих способностью к хорошей экспрессии в клетках бактерий.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является на примере производных оболочечного белка Gc хантавирусов отработать универсальную методологию препаративного получения рекомбинантных вирусных антигенов, используя комбинацию различных методов.
В соответствии с целью поставлены следующие задачи:
1. Апробировать подход к конструированию эффективных продуцентов делеционных вариантов белка Gc хантавируса Добрава, основанный на предсказании доменной организации этого белка по аналогии с оболочечными белками флавивирусов.
2. На основе анализа опубликованных данных пептидного эпитопного картирования белка Gc хантавируса Добрава предложить структуру короткого иммунодоминантного пептида, добиться его высокоэффективной экспрессии в растворимой форме в составе би- и три-функциональных слитых белков.
3. На модели неструктурного белка NS5a ВГС отработать систему конструирования банков делеционных производных in vitro с помощью ПЦР со случайной затравкой и скрининга этого банка путём отбора клонов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.
4. С использованием скринингового метода получить набор делеционных производных белка Gc хантавируса Пуумала, обладающих способностью к высокоэффективной экспрессии в E. coli. Отобрать среди них иммуноположительные варианты.
5. Изучить и сопоставить технологические и иммунохимические свойства полученных рекомбинантных антигенов. Сконструировать на их основе лабораторные тест-системы для иммунохимической детекции специфических антител больных ГЛПС.
Научная новизна работы. Впервые в мире получены бактериальные продуценты рекомбинантных белков - производных поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, обладающие нормальной жизнеспособностью и обеспечивающие возможность очистки продукта. Полученный результат впервые экспериментально подтвердил теоретическую модель доменной организации белка Gc, в том числе, предположение о необходимости удаления из структуры рекомбинантного белка петли слияния, обладающей кинетизмом и склонной к взаимодействия с мембранами. Отработана система оценки выхода рекомбинантных белковых продуктов в растворимой форме in vivo на основе цветных флуоресцентных белков. Создана и апробирована полностью оригинальная система конструирования банков делеционных производных на основе ПЦР с вырожденным праймером и векторная система для скрининга этих банков на способность к экспрессии in vivo. C помощью новой системы получены делеционные производные неструктурного белка NS5a вируса гепатита С и поверхностного белка Gc хантавируса Добрава, не токсичные для клеток продуцента и обладающие способностью к высокоэффективной продукции в бактериях с образованием растворимого продукта.
Практическая ценность работы. Наибольшей практической ценностью среди результатов работы обладает новая система для конструирования и скрининга банков делеционных производных. Она позволяет в короткие сроки получать производные генов любых вирусных и других белков с оптимальными биотехнологическими характеристиками продукта: отсутствие токсичности, высокая растворимость и эффективность биосинтеза. В дальнейшем за счет иммуноскрининга таких белков могут быть отобраны варианты, обладающие наилучшими иммунохимическими характеристиками. Практической ценностью для конструирования серодиагностических тест-систем обладают белок NC-Dob на основе поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, лишенный трансмембранного участка и петли слияния и белок S3 - производное неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С, а также, возможно, производные поверхностного антигена Gc хантавируса Пуумала, отобранные в результате скрининга. Практическую ценность для создания искусственных слитых белков с оптимальными биотехнологическими свойствами, в частности, пептидных антигенов без устойчивой собственной вторичной структуры, могут представлять плазмидные конструкции на основе цветных белков, фолдона фибритина фага JS98C3 и легкой цепи протеазного ингибитора PKPI-B1.
Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Bari Intern. Symposium on «Мitochondrial. physiology and pathology» IUDMB Sympos. S1 Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.
Биологические материалы. Бактериальные штаммы и векторы
В работе для проведения генно-инженерных работ и наработки плазмидной ДНК использовался штамм E. coli TG1 (thi, proAB, LacZ, F'[proAB, LacZ-M15]). Для создания экспрессионных штаммов на основе промотора фага Т7 использовались штаммы С41(DE3, thi, proAB, LacZ, F'[proAB, LacZM15]) и JM109 (e14- (McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+) supE44 relA1 (lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZM15] (Promega)).
Векторами для получения экспрессионных конструкций служили pQE30 на основе промотора фага Т5 (Invitrogen) и pET23a на основе промотора фага Т7 (Novagen). Необходимо отметить, что индукция промотора Т7 в клетках E. coli требует РНК-полимеразы фага Т7, ген которой под контролем промотора Lac-UV обычно доставляется с помощью интегративной конструкции DE3. Эта особенность конструкции DE3 позволяет индуцировать её экспрессию с помощью лактозы или IPTG. Промотор T5 в составе pQE30 содержит лактозный оператор LacO, что также допускает его индукцию с помощью IPTG. Однако, на практике индукция pQE30 как правило слабо сказывается на уровне продукции рекомбинантных белков, кодируемых производными pQE30. В случае векторов серии pET23 этот эффект выражен сильнее. Конструкция pQE30-GFP с геном зеленого флуоресцентного белка на основе pQE30 предоставлена Т.В. Кузнецовой (национальный институт здравоохранения, Таллинн). Конструкции pQE-YFP и pQE-RFP, содержащие гены жёлтого и красного флуоресцентного белка с добавленным 6His-тагом на N_конце соответственно, были предоставлены Е.С. Маракасовой (университет им. Дж. Мэйсона, Вирджиния, США). Зелёный белок имеет максимум возбуждения 483 нм, и эмиссии 506 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagGFP2-C (кат. номер FP191). Красный белок TagRFP имеет максимум возбуждения 553 нм, и эмиссии - 574 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTurboRFP-C (кат. номер FP231). Жёлтый белок TagYFP имеет максимум возбуждения 508 нм, и эмиссии - 524 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagYFP-C (кат. номер FP131). Конструкция pQ-Kn1 с геном ингибитора Кунитца PKPI-B1 из клубней картофеля предоставлена А.С. Сперанской (институт молекулярной биологии им. А.Н. Энгельгардта РАН). Конструкция pET-cd-32, содержащая ген фолдона фибритина фага JS98C3, была предоставлена О.Р.Латыповым (институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН).
Вирусный материал.
Для клонирования гена Gc использовался вирусный материал штаммов Добрава Aa1854/Lipetsk и Пуумала К-27 из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН.
Сыворотки больных.
В работе использовались сыворотки больных ГЛПС из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные Н.А. Коротиной в 2007-2012 г.
Сыворотки больных гепатитом С из коллекции лаборатории этиологии, диагностики, эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные И.В. Гордейчуком.
Лабораторные реактивы.
В работе использовались ферменты обмена ДНК, молекулярно-массовые стандарты ДНК и белка производства MBI Fermentas, обратная транскриптаза AMV (MBI Fermentas), термостабильная полимераза SmartTaq (Диалат, Москва). Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля использовался набор DNA Extraction kit (MBI Fermentas, каталожный номер #K0513) и Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, каталожный номер #A2180). Для выявления связывания иммуноглобулинов человека использовался меченный пероксидазой конъюгат против -цепей IgG (Sigma, каталожный номер A8419). Для выявления связывания кроличьих антител использовался конъюгат козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой P-GAR-Iss (Имтек, Москва).
Олигонуклеотиды.
В работе были использованы олигонуклеотиды, производства «ЗАО Синтол», следующего состава:
Dob-G2N
GGGGTACCATGGAAGGATGTCTTTA(A/G)GTTTAACCTAGGAT
Dob4 ggggatccATAACACCTCAATCAACTAGC
Dob-G2CL ttc ccg gga ACTGCATGTGGGTTATATCTTGAC
Dob2 GGGTCGACccAGTTCCCATTAAAGATACCCTT
HS3 CAGGAAGAAATGCAACTTTGC
HS4 GAAGGTTATCAAAGTCAATGT
Li1 CTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT
Li2 AATTAATTCCTCCGGCGCCCCC
Li4 GGAGATCTCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT
HT12 GGACTAGTATCAAAGTCAAGTGCCTT
ECFP1 GGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
ECFP2GGAGATCTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
Li3ggagatctGCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATTAATTCgag
Lac_for1 GGGTCGACACCATGATTACGGATTCACTG
Lac_rev1GGAAGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTG
1b_6117_S_L TCCCCCACGCACTATGTGCC
1b_7780_AS_L CGGTARTGGTCGTCCAGGAC
supl GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNN
supl-11GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNN
supl-17
GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNNNNNNNN
ES1 GGGGATCCGCAGCATCCGGAGC
ES3 GGGGATCCGCAGCATCCG
PUU2 gcaaaacttagggcttatgttct
PUU4 gtgaaaagagagtaccagaaaaca
Методы.
Ферментация рекомбинантного продуцента.
Для экспрессии конструкций на базе вектора pQE-30 и производных векторов с промотором гена 10 фага Т7 использовали штаммы C41(DE3) и JM109 (Promega). Для получения инокулята, в ходе ферментации использовали смыв биомассы рекомбинантного штамма со свежих чашек, имеющих возраст не более 30 ч с момента высева трансформантов на агаризованную селективную среду. Селективная среда представляла собой LB агар с 0,4% глюкозой и 100 мг/л ампициллина. Культивирование рекомбинантных штаммов на агаризованной среде происходило при температуре не более 30°С. Образовавшиеся колонии смывали с чашки диаметром 90 мм свежей средой LB объемом 6 мл и использовали полученный смыв для засева колб Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 30 мл соответствующей жидкой среды с 100 мг/л ампициллина.