Автореферат: Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

Подготовка образцов к электрофорезу.

Биомассу собирали центрифугированием в 40 мл флаконах (8000 об/мин, 30 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Биомассу промывали дистиллированной водой или физраствором, переосаждали и ресуспендировали в буфере (0,005М ЭДТА, 0,05 М Tris-HCl, рН=8,0), содержащим лизоцим (1 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 1-2 ч при температуре 30°С. Затем клетки разрушали при помощи стеклянных шариков в течение 10 мин. Полученную клеточную суспензию разделяли на растворимую и нерастворимые фракции при помощи центрифугирования (8000 об/мин, 60 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Нерастворимую фракцию ресуспендировали в буфере для обработки лизоцимом.

Для каждого образца отбирали по 20 мкл растворимой и нерастворимой фракции. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин на настольной центрифуге Eppendorf D5424, промывали последовательно 100 мкл воды и 100 мкл 50% ацетона, полученный осадок подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ?-меркаптоэтанола, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Для проведения электрофореза в квазинативных условиях образец после суспендирования в буфере Лэммли сразу, без прогревания, наносили в лунки полиакриламидного геля. Растворимую фракцию осаждали добавлением 20 мкл 100% ацетона и последующим центрифугированием на настольной центрифуге, полученный осадок промывали 50% ацетоном, подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ?-меркаптоэтанол, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Пробы наносили на форез из расчета 4 мкл на трек.

Выделение тотальной вирусной РНК из инфицированных клеток.

1. Конфлюентный монослой клеток Vero-E6 в пластиковых матрасах с площадью поверхности 25 см2 заражали вирусом и культвировали в инкубаторе при +37°С в течение 4-6 дней после заражения.

2. Из матраса с клетками декантировали культуральную жидкость, промывали 4 мл физиологического раствора.

3. Добавляли 1 мл TRI reagent (Sigma) на матрас, вызывая лизис клеток. Время обработки не превышало 1 мин.

4. Клеточный гомогенат переносили в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл.

5. В каждую пробирку с гомогенатом добавляли 500 мкл хлороформа и суспендировали на ручном встряхивателе. Центрифугировали на настольной центрифуге при 10000 об/мин без охлаждения.

6. Отбирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку и добавляли равный объем хлороформа. Центрифугировали при 10000 об/мин на настольной центрифуге в течение 1 мин, получая разделение эмульсии на две фазы. Отбирали верхнюю фазу.

7. Для осаждения РНК добавляли к водному экстракту изопропанол в объемном соотношении1:1 к отобранной жидкости.

8. Для обессоливания осадка добавляли к нему 100 мкл 70% водного этанола, который затем удаляли с помощью водоструйного насоса. Осадок высушивали при +37С.

9. Выделенную суммарную РНК растворяли в 50 мкл воды и визуализировали при помощи электрофореза в 1,3% агарозном геле.

Обратная транскрипция

Реакцию проводили в лабораторном термостате «Гном» (ДНК-Технология).

Реакционная смесь (20 мкл) содержала следующие компоненты

5? буфер AMV: 250 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 40 мM MgCl2, 150 мM KCl, 5 мM ДТТ

Режим реакции был следующим: 10 мин при +25°С, затем 60 мин при +50°С. Реакцию останавливали прогревание до +85 С в течение 5 мин.

Иммуноферментный анализ.

Планшеты активировали белком-антигеном, внося по 100 мкл раствора с содержанием общего белка 10 мкг/мл в каждую лунку. Антиген разводили в карбонат-бикарбонатном буфере (КГБ), рН=9,6. После инкубации в течение 18 ч при 4°С плашки блокировали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина по 100 мкл на лунку, инкубируя плашки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки отмывали и вносили по 50 мкл сывороток больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала), здоровых доноров или животных в серии разведений от 20 до 1280 раз в буфере для ИФА (PBS, 0,1% БСА, 0,01% твин-20) и оставляли на 2 часа при 37С. После отмывки в лунки вносили меченные пероксидазой хрена IgG антивидовые антитела (Sigma) и инкубировали 1 ч при 37°С. Конъюгат удалали и промывали лунки на вошере или в ручную.

Для проведения ферментативной реакции вносили в лунки субстратно-индикаторную смеси (ТМБ 10 мкг/мл, пероксид водорода 0,01% в цитрат-фосфатном буфере). Через 20 минут реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение поглощения при 492 нм проводили после отмывки и на спектрофотометре «Эфос 9305» (ОАО МЗ «Сапфир»).

Измерение ?-галактозидазной активности.

В лунках планшета смешивали по 20 мкл образца (растворимой или нерастворимой фракции грубого клеточного лизата) и 50 мкл ферментной смеси (Трис-глициновый буфер pH 8,6, содержащий 0,02% X-gal). Планшеты с реакционной смесью инкубировали при 37°С в течение 15 ч. Измерение оптической плотности проводили при 620 нм на спектрофотометре «Microplate Reader» Model 680, BioRad.

Результаты СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Необходимой предпосылкой для получения рекомбинантных производных поверхностных антигенов хантавирусов в бактериях является выявление в его структуре доменов, обладающих автономной структурной стабильностью (Cong, 2012). Для решения этой задачи возможно использование одного из двух возможных методов: рационального дизайна или скрининга. Современные принципы предсказания доменной структуры и рационального дизайна искусственных белков на этой основе, включающие общедоступные компьютеризованные сервисы, описаны в работе (Huang, 2013). Современные методы скрининга описаны в работе (Listwan, 2009). В нашей работе для получения антигенов поверхностных белков хантавирусов использованы оба способа.

Конструирование продуцентов антигенов вируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна.

Белки, моделирующие N- и С-концевые домены белка Gc хантавируса Добрава.

Сопоставление данных анализа аминокислотной последовательности белков внешней оболочки Буньявирусов (хантавирусы, RVFV и UUKV) и других оболочечных вирусов, прежде всего, вируса Леса Семлики (SFV) (Hepojoki et al., 2010) позволило сделать некоторые выводы о распределении функциональных детерминант в первичной структуре белка Gс. Этот белок, подобно антигену E1 флавивирусов, а также буньявирусов RVFV и UUKV, принадлежит к белкам слияния II класса, а следовательно, в его составе имеется участок, выполняющий функцию так называемой «петли слияния», ответственной за проникновение нуклеокапсида из вторичной фагосомы в цитоплазму (Рис. 1). Этот участок достаточно консервативен для различных видов хантавирусов. У вируса Добрава он имеет последовательность CYGACTKYEYPWHTARCHFERDFEYENSWSCNPADCPGIGTGC. В составе вириона петля слияния находится во внутренней части глобулы Gc, но при закислении рН, вызванного попаданием вирусной частицы во вторичную фагосому, она перемещается на поверхность белка, где вступает в контакт с рецепторами и мембраной инфицируемой клетки. Таким образом, петля слияния не обладает автономно устойчивой вторичной структурой, а конфигурируется определённым образом только в присутствии мембраны. Кроме того, петля слияния обогащена заряженными и ароматическими остатками, имея в целом отрицательный заряд. Эта особенность придает ей склонность к агрегации, снижает растворимость белка.

Рис. 1. Схема доменной организации поверхностных гликопротеинов Gn и Gc, хантавирусов, образующихся при созревании продукта трансляции М-сегмента генома

В работе Hepojoki 2010 г путём сопоставления последовательности белка Gс с последовательностями и расшифрованными третичными структурами интегральных трансмембранных белков III класса был сделан расчёт, позволяющий предсказать расположение в ней петли слияния, ответственной за распознавание вирусом рецептора на клеточной поверхности в момент инфекции и выход нуклеокапсида из первичной фагосомы в цитоплазму инфицированной клетки. По аналогии с белками слияния флавивирусов, расчеты показали наличие в структуре белка Gc автономно стабильных доменов к N- (один) и С-концу (два). На основании этих выводов появилась возможность сконструировать мутантный вариант белка Gc, лишенный петли слияния и не способный неспецифически интегрироваться в мембраны. Можно ожидать что токсичность такого белка к клеткам продуцента будет существенно снижена, а иммуногенность не изменится, поскольку петля слияния является внутренним компонентом глобулы и не может участвовать в реакции нейтрализации вируса.

Эксперименты с белком вируса Добрава Lipetsk Aa были выполнены методами рационального дизайна. Три конструкции были предназначены для получения изолированных N- и С-концевых доменов, предсказанных в работе (Hepojoki et al, 2010). Анализ свойств продуцентов, несущих описанные конструкции, позволил подтвердить предположение о том, что токсичность белка Gc в значительной мере обусловлена наличием в его структуре петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической части. Вместе с тем, ?-слойный домен, лежащий к N-концу от петли слияния также обладает повышенной склонностью к агрегации, что отрицательно сказывается на его выходе и снижает эффективность трансформации E. coli соответствующей конструкцией. Искусственный вариант белка pQYNС-Dob, в котором N- и С-концевые домены вместо петли слияния сочленены через искусственный глицин-сериновый пептидный линкер, позволило получить штамм, обладающий высокой жизнеспособностью и продуктивностью (Рис. 2). Более того, такой белок с некоторым выходом принимал нативную конформацию в клетках продуцента, что проявлялось и в наличии у него способности к флуоресценции при возбуждении длинноволновым УФ светом.

Рис. 2. Схема конструкции pQYNС-Dob, кодирующей слитой белок в составе EYFP и делетированного производного белка Gc хантавируса Добрава, лишенного петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической частей

Антигены, моделирующие шарнирный район на стыке двух С-концевых доменов хантавируса Добрава.

В работе (Koch and Liang, 2003) методом эпитопного картирования с использованием синтетических пептидов в пределах белка Gc хантавируса Добрава выделена область, предположительно участвующая в формировании конформационно-зависимых эпитопов антител человека. Согласно данным работы (Hepojoki et al, 2010) эта область находится на границе двух С-концевых доменов белка Gc, один из которых отвечает за димеризацию этого белка. С учётом данных обеих работ нами впервые предложена последовательность фрагмента белка Gc, не проявляющая токсичности по отношению к клеткам продуцента и пригодная для высокоэффективной экспрессии в E. coli. Этот пептид длиной 72 а.о. получил рабочее название НТ.

В результате экспериментов по конструированию продуцентов антигенов хантавируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна был получен набор конструкций, сведения о которых представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Свойства конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава

Полученные конструкции исследовали по следующей схеме:

1. Оценка выхода и растворимости белковых продуктов;