Автореферат: Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

2. Очистка и характеристика продуктов, включая антигенные свойства;

3. Исследования иммуногенности продуктов;

4. Разработка тест-систем для выявления антител против хантавирусов с использованием полученных рекомбинантных антигенов.

Первым этапом испытания эффективности и технологической пригодности созданных экспрессионных конструкций для получения производных белка Gc хантавируса Добрава стало исследование выхода целевого продукта при использовании различных штаммов E. coli, оптимизация условий культивирования штамма и установление доли белка, остающегося в растворимой клеточной фракции после отделения агрегатов денатурированного белка (телец включения). При этом принимали в расчёт возможность использования двух альтернативных технологических схем очистки продукта:

1. Получение продукта непосредственно в нативной (водорастворимой) форме с очисткой белка методом металлохелатной хроматографии на Ni-NTA-агарозе;

2. Получение продукта в виде телец включения с последующей солюбилизацией, очисткой в денатурирующих условиях и (при необходимости) ренатурации.

Поскольку для вирусных антигенов, в целом, и для белка Gс хантавирусов, в частности, характерно токсическое воздействие на клетки бактериальных продуцентов, прежде всего, был проведён тест на эффективность трансформации E. coli штаммов TG1, C41(DE3) и JM109.

Затем проводилось исследование выхода белка при использовании различных штаммов. Выход белка оценивали с помощью денатурирующего электрофореза белков с последующей окраской геля Кумасси R-250 или Понсо-S после электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану и денситометрией красителя, связанного с полосой белка с ожидаемого молекулярной массой. В качестве критерия нативности целевого белка использовали распределение продукта между водорастворимой и нерастворимой клеточными фракциями. Необходимо учитывать, что результаты этого теста во многом искажаются недостаточной стандартизируемостью процедуры гомогенизации клеточной культуры, которая не всегда приближается к 100% и с трудом может быть оценена. Кроме того, эффективность разделения клеточных фракций при центрифугировании также во многом определяется размерами мембранных липосом и фрагментов клеточной стенки, образующихся при гомогенизации биомассы. Таким образом, результаты тестов на растворимость белка всегда должны восприниматься с осторожностью. В качестве дополнительного критерия использовали флуоресцентную активность цветных белков, которая проявляется только при накоплении продукта в нативной форме.

Таблица 2. Характеристика свойств продуцентов на основе конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава

Результаты испытаний показали, что продукты большинства конструкций, включая изолированный пептид НТ - продукт конструкции pET-HT-12, накапливаются в нерастворимой клеточной фракции с выходом от 8 до 93 мг/л культуры. При этом пептид HT и изолированный N-концевой домен белка Gc (продукт конструкции pQYN-Dob) накапливаются с наименьшим выходом.

Продукт конструкции pQRC-Dob образуется с несколько более высоким выходом (до 22 мг/л), причём на этом показателе, возможно, отрицательно сказываются свойства белка-носителя RFP, склонного к агрегации, и дающего меньший выход при экспрессии в E. coli по сравнению с EYFP. На этом основании можно предположить, что именно N-концевой домен белка Gc хантавируса Добрава негативно влияет на жизнеспособность продуцентов полноразмерного Gc наряду с петлей слияния. Это предположение дополнительно подтверждается пониженным выходом трансформации E. coli ДНК конструкции pQYN-Dob.

Наибольшей технологической эффективностью обладает продукт конструкции pYNC-Dob, представляющей собой полноразмерный белок Gc, лишенный петли слияния, трансмембранного и цитоплазматического доменов и слитый с белком-носителем 6His-EYFP. Этот белок накапливается в штамме-продуценте с выходом до 93 г/л, причем доля растворимого продукта достигает 10%. Этот продукт флуоресцирует в полиакриламидном геле при использовании «квазиденатурирующего» метода обработки образцов, подразумевающего обработку биомассы буфером Лэммли с SDS при комнатной температуре, без тепловой денатурации. Известно, что цветные флуоресцентные белки в этих условиях солюбилизируются, но сохраняют способность к флуоресценции, утрачивающуюся при кипячении образцов. Это результат показывает целесообразность решения удалить из состава Gc петлю слияния, дестабилизирующую структуру белка за счет склонности к конформационной перестройке и обладающую высоким сродством к мембранам. Не исключено, что улучшение технологических свойств продукта конструкции pYNC-Dob может быть достигнуто за счет дополнительной оптимизации структуры глицин-серинового линкера, соединяющего N-концевой и С-концевые домены.

Характеризуя свойства конструкций, предназначенных для получения производных пептида HT (шарнирный район на границе двух С-концевых доменов белка Gc) необходимо отметить эффективность решения по его размещению в центре трифункционального слитого белка. Конструкции pHK6 и pGHF, созданные по этому принципу, позволяют в три раза повысить выход белка по сравнению с конструкцией pET-HT-12. Правда, при этом необходимо учитывать, что пептид HT по массе составляет лишь 1/6 часть белков искусственных белков HK6 и GHF, таким образом, молярный выход продукта при использовании продуцентов на основе pHK6 и pGHF не превышает выхода для pET-HT-12. Кроме того, использование конструкции pGHF, кодирующей пептид НТ в слиянии с внутримолекулярным шапероном - фолдоном фибритина фага JS98C3 и дополнительным пептидным линкером на С-концевой границе GFP, позволяет добиться частичного перехода целевого продукта в растворимую фазу (с выходом <5% от общей массы целевого белка в культуре). В совокупности эти данные позволяют утверждать, что нами разработан эффективный метод получения пептида HT. Этот подход, вероятно, может быть применим и для создания продуцентов других пептидов-антигенов, имеющих технологическую ценность.

Характеризуя особенности белка, в котором носителем пептида НТ выступает LacZ, необходимо отметить низкий уровень его продукции и растворимости, неожиданные для собственного белка E. coli. Однако, необходимо отметить, что эти особенности присущи ?-галактозидазе и при естественной экспрессии в штаммах дикого типа. В то же время, наличие у белка HT-LacZ ферментативной активности, выявляемой с помощью хромогенного субстрата X-gal, резко повышает чувствительность и специфичность его детекции как в цельных клетках, так и во фракциях клеточного лизата. Благодаря этому удалось достоверно обнаружить и количественно оценить уровень накопления растворимого белка. Более того, белок HT-LacZ в дальнейшем был использован для создания тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа «обратный сэндвич», в котором выполнял функцию антивидового конъюгата для выявления иммунных комплексов антител человека, сформированных на поверхности планшета. Таким образом, белок HT-LacZ оказался ценным исследовательским инструментом, позволившим охарактеризовать биотехнологические и иммунологические свойства пептида HT.

В заключение необходимо отметить роль штамма E. coli в повышении выхода продукта. Для большинства конструкций наилучшие результаты были достигнуты при использовании наиболее быстро растущего штамма TG1. Однако, в случае конструкции pET-HT-12 наилучшие результаты дал штамм C41(DE3). Этот результат, вероятно, объясняется наличием в штамме C41(DE3) эписомы DE3, несущей ген РНК-полимеразы фага Т7, которая, в свою очередь, запускает работу промотора Т7 в составе вектора pET23a, на базе которого получена конструкция pET-HT-12. Все прочие конструкции, описанные в настоящей главе, получены на базе вектора pQE30 с промотором фага Т5, который не зависит от активности полимеразы фага Т7. Кроме того, согласно утверждениям разработчиков C41, этот штамм обладает повышенной устойчивостью к токсичным гидрофобным рекомбинантным продуктам. В то же время, конструкции pQYN-Dob и pGHF, проявляющие явные признаки токсичности для всех штаммов, оказались менее совместимы со штаммом C41(DE3), чем с более традиционным TG1. Это позволяет считать наиболее принципиальным эффект наличия в штамме эписомы DE3.

В случае конструкции pQL-HT наилучшие результаты были получены при использовании медленно растущего штамма JM109, имеющего ноль-мутацию в гене recA. C учётом сделанных наблюдений, в дальнейших экспериментах по препаративной наработке белка для конструкции pET-HT-12 в качестве штамма-хозяина использовался C41(DE3), для pQL-HT - JM109, для прочих конструкций - TG1.

Исследования иммуногенности белка HT-12.

Полученный препарат белка HT-12 был использован для выработки поликлональных антител путём иммунизации кроликов. В эксперименте участвовало два беспородных кролика, которые подвергались четырехкратной иммунизации. Интервал между первой и второй иммунизацией составил 4 недели, в дальнейшем иммунизацию проводили 1 раз в 2 недели. Кровь отбирали из ушной вены дважды от каждого животного через две и три недели по окончании последней иммунизации. Сыворотку получали путем декантирования со сгустка после инкубации цельной крови при +4С в течение 4 часов. Всего было получено 50 мл сыворотки от каждого животного.

Наличие специфических антител в иммунных сыворотках кроликов исследовали методом иммуноблоттинга с применением в качестве антигена белка HT-12 и хроматографически очищенного лизата вируса Добрава.

Проведенный электрофоретический анализ показал высокую специфичность реакции антител, выработанных обоими кроликами, по отношению к гомологичному антигену. Сыворотки не снижали реакционной способности при разведении до 4000 раз и не реагировали с примесными белками E. coli, содержащимися в препарате HT-12 в концентрации до 15% от общего белка. Преимунная сыворотка кролика №1 не обнаружила какой-либо реакции с использованным антигеном.

Убедившись в высокой активности антител, накопившихся в сыворотках кроликов по отношению к антигену HT-12, мы приступили к изучению реакционной способности этих антител в отношении белков вируса Добрава. Эксперимент проводили также методом иммуноблоттинга, используя в качестве антигена хроматографически очищенный лизат вируса Добрава.

Рис. 3 Изучение иммунологической реакции антител иммунной сыворотки кролика №1, полученной при иммунизации белком HT-?12, с антигенным материалом лизата хантавируса Добрава. Белки концентрированного лизата вируса Добрава разделены в денатурирующем 12,5% ПААГ, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены: (1) преимунной сывороткой кролика №1; (2) иммунной сывороткой кролика (визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена; (3) сывороткой крови больного ГЛПС (инфицирован вирусом Добрава): визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена. Стрелкой отмечено расположение белка Gc (50 кДа)

Анализ данных Рис. 3 показывает, что иммунная сыворотка кролика №1, в отличие от его же преимунной сыворотки, выявляет единственную полосу белка, соответствующую 50 кДа. Эта же полоса окрашивается антителами больного ГЛПС, инфицированного вирусом Добрава. Эта полоса соответствует индивидуальному белку внешней оболочки Gc, наиболее иммуногенному в составе вируса, хотя другие антигены (Gn и N) с учётом гликозилирования практически не отличаются от него по подвижности.

Тест-система на основе белка НК6.

Анализ проводился методом тИФА с сорбцией рекомбинантного белка-антигена НК6 на поверхность планшета (Рис. 4). Использовался очищенный белок НК6 в денатурированной форме. Реакция демонстрирует специфичность созданного прототипа диагностикума к виду хантавируса: антитела всех обследованных пациентов, инфицированных вирусом Добрава или близким вирусом Хантаан, показывают реакцию, отличную от нормы. При обследовании двух пациентов, инфицированных вирусом Пуумала, только один обнаружил реакцию с антигеном HK6, а второй не отличался по уровню сигнала от здоровых доноров. При использовании в качестве диагностического антигена N-белка отличий в реакционной способности антител больных, инфицированных вирусами Пуумала и Добрава, практически не наблюдается. Созданный прототип тест-системы на основе белка HK6 обладает более высокой способностью к идентификации вида хантавируса, чем существующие диагностикумы на основе N-белка.