Статья: Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количе-ственных признаков у растений

К л о н и р о в а н и е г е н о в, д е т е р м и н и р у ю щ и х ф е н о т и п и ч е с к и й п р и з н а к. Как показано выше, положение QTL на карте сцепленного наследования представляет собой лишь приблизительную оценку физической локализации на хромосоме генов (гена), вовлеченных в детерминирование фенотипического признака. В этой связи исследователей, работающих над проблемами селекции, не удовлетворяет простая идентификация хромосомного сегмента, заключающего в себе QTL; они пытаются осуществить физическое клонирование QTL-локуса, что определяет необходимость изолировать и прочитать нуклеотидную последовательность, содержащую искомый ген, размером максимум в несколько тысяч пар нуклеотидов. Для этого QTL должен быть локализован на хромосоме возможно более точно с помощью генетической карты высокого разрешения (high-resolution linkage map), которая создается на основе скрещивания двух почти изогенных линий, имеющих практически идентичный геном за исключением фрагмента хромосомы, содержащего анализируемый QTL. Таким образом размер искомого участка QTL может быть сведен к 1-2 сМ, который, однако, по-прежнему может вмещать несколько сотен генов (48). Для того чтобы перейти от шкалы генетических расстояний, измеряемых в сМ, к физической ДНК-последовательности длиной несколько тысяч пар нуклеотидов, необходимо осуществить широкомасштабный анализ библиотеки фрагментов геномной ДНК с помощью молекулярных маркеров, прилежащих к QTL, и выявить клон, содержащий искомую ДНК-последовательность. Расшифровка нуклеотидной последовательности такого клона и выявление в ней возможных рамок считывания позволят наметить несколько вероятных генов-кандидатов. Окончательным доказательством того факта, что ген-кандидат определяет изучаемую фенотипическую изменчивость, является процедура генетической трансформации модифицированной ДНК-последовательности выявленного и клонированного гена-кандидата в реципиентный организм, сопровождающаяся статистически достоверным изменением фенотипа (complementation test).

Описанный подход получил название «клонирования на основе генетической карты» (map-based cloning) и его классическим примером служит идентификация генетического локуса, определяющего размер плода у растений томата (49). Это исследование представляет собой первый опыт клонирования гена, детерминирующего количественный хозяйственно ценный признак у возделываемого вида растений, и стратегия этого исследования заслуживает специального краткого изложения.

Участок хромосомы, содержащий ген, вовлеченный в формирование признака «размер плода» у растений томата, был идентифицирован посредством QTL-анализа расщепляющейся популяции, полученной от скрещивания культивируемого томата Lycopersicon esculentum (крупные плоды) и родственного дикорастущего вида L. penellii (мелкие плоды). В результате проведенных исследований был обнаружен QTL, названный fw2.2. Полиморфизм аллелей в этом QTL-локусе хромосомы объяснял до 30 % изменчивости изучаемого фенотипического признака. С помощью близлежащих молекулярных маркеров из имеющейся YAC-библиотеки (Yeast Artificial Chromosomes) был идентифицирован физический клон ДНК длиной около 300 тыс. п.н., содержащий искомый QTL (50).

Для того чтобы получить представление о возможном числе функционирующих генов, содержащихся в идентифицированной ДНК-последовательности, YAC-клон был использован для гибридизации с клонами библиотеки кДНК, которая была создана на базе генома родительской формы с мелкими плодами и состояла только из фрагментов нуклеотидной последовательности генов, экспрессируемых в этом геноме. Выяснилось, что идентифицированный YAC-клон включает четыре транскрибируемые кДНК-последовательности, соответствующие четырем возможным генам-кандидатам. Линейный порядок расположения последних на хромосоме был определен с помощью все той же генетической карты высокого разрешения. Параллельно из библиотеки фрагментов геномной ДНК, сохраняемых в космидном векторе, были идентифицированы и секвенированы четыре фрагмента геномной ДНК (длиной до 50 тыс. п.н.), соответствующие генам-кандидатам. Каждый из этих ДНК-клонов с помощью методов генетической трансформации был перенесен в геном культивируемых растений двух разновидностей томата с крупными плодами. В результате у одного из четырех полученных классов трансформированных растений, содержащих встроенный геномный клон с доминантным аллелем «мелкоплодности», размер плода достоверно уменьшился по сравнению с контролем. Таким образом был идентифицирован ген, названный авторами ORFX, контролирующий размер плода у растений томата. При этом было показано, что полиморфизм аллелей этого гена определяет скорость деления и число клеток в тканях завязи цветка.

В настоящее время клонировано всего восемь генов, детерминирующих QTL у растений (табл.) (51). За исключением гена tb1 у кукурузы, все они были идентифицированы с помощью описанной выше процедуры клонирования на основе генетических карт. Некоторые из этих генов кодируют факторы транскрипции, другие отвечают за структуру белков, непосредственно вовлеченных в биохимические процессы метаболизма. Два из трех генов, детерминирующих сроки цветения растений риса, оказались гомологичны аналогичным генам у растений Arabidopsis. Следовательно, методы сравнительной геномики можно использовать для молекулярного анализа проявления фенотипических признаков у различных видов растений.

Заключение

В последние десятилетия во многих странах Западной Европы и США в прикладных генетико-селекционных программах интенсивно применяют картирование QTL с помощью молекулярных маркеров. Практически для всех основных возделываемых культур растений созданы экспериментальные популяции (рекомбинантные, имбредные или гаплоидные

Гены, детерминирующие количественные хозяйственно ценные признаки у растений различных видов (цит. по 51)

линии) и на их основе сконструированы генетические карты, насыщенные молекулярными маркерами. Число ДНК-маркеров на уже составленных картах сцепленного наследования варьирует от нескольких сотен до нескольких тысяч на геном. Как правило, после опубликования полученных результатов исходные данные о полиморфизме молекулярных маркеров (mapping data) и о варьировании фенотипического признака становятся доступными для мирового сообщества посредством мировой сети Интернет. Заинтересованность научных лабораторий и селекционных компаний в предоставлении семенного материала своих популяций для пополнения генетических карт новыми маркерами или QTL-анализа других фенотипических признаков базируется на очевидной экономической выгоде использования этих подходов в селекции возделываемых культур. На практике доступ к этим данным означает возможность локализации на уже существующей генетической карте практически любого локуса, представляющего интерес для исследователя, включая возможность установления того, насколько достоверно полиморфизм такого локуса влияет на фенотипическую изменчивость (без проведения многолетних полевых испытаний). В то же время можно осуществлять QTL-анализ и для множества других количественных (фенотипических) признаков, не проводя дополнительных лабораторных молекулярных исследований.

Важным аспектом изучения генетической основы количественных признаков является вопрос, насколько можно воспроизвести факт обнаружения QTL в различных экологических условиях произрастания картируемой популяции. Хотя проверка воспроизводимости QTL является необходимым условием исследований, такого рода повторность обычно подтверждается параллельными экспериментами в близлежащих географических пунктах или в одном и том же месте, но в разные годы. Существует острый дефицит информации о том, насколько стабильны обнаруженные QTL при выращивании популяций в действительно контрастных природно-климатических зонах. Анализ такой QTL-динамики позволит внести существенный вклад в понимание сложных механизмов взаимодействия генотип--среда и выявить ключевые генетические факторы для изучаемых количественных признаков, минимально подверженных воздействию внешних факторов и представляющих наибольший интерес для селекционеров.

Несмотря на то, что интенсивное развитие молекулярно-биологических технологий приводит к появлению новых подходов для выявления генетических детерминант фенотипических признаков, картирование QTL с помощью молекулярных маркеров наряду с классическими методами генетики и селекции остается на сегодня отправным пунктом в изучении изменчивости количественных признаков. В связи с этим необходимо отметить, что создание новых картированных популяций на базе отечественных сортов, адаптированных к разнообразным условиям возделывания в пределах различных экологических зон России, внесло бы неоценимый вклад в развитие отечественных прикладных генетических и селекционных исследований.

Л И Т Е Р А Т У Р А

The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 2000, 408: 796-815.

G o f f S.A., R i c k e D., L a n T.H. e.a. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 2002, 296: 92-100.

Y u J., H u S., W a n g J. e.a. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science, 2002, 296: 79-92.

R a f a l s k i A.J. Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based approaches. Plant Science, 2002, 162: 329-333.

B u c k l e r E.S., T h o r n s b e r r y J.M. Plant molecular diversity and applications to genomics. Current Opinion in Plant Biology, 2002, 5: 107-111.

B a u d r y E., K e r d e l h u e C., I n n a n H. e.a. Species and recombination effects on DNA variability in the tomato genus. Genetics, 2001, 158(4): 1725-1735.

G a u t B.S., C l e g g M.T. Nucleotide polymorphism in the Adh1 locus of pearl millet (Pennisetum glaucum) (Poaceae). Genetics, 1993, 135(4): 1091-1097.

C u m m i n g s M.P., C l e g g M.T. Nucleotide sequence diversity at the alcohol dehydrogenase 1 locus in wild barley (Hordeum vulgare ssp. spontaneum): an evaluation of the background selection hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(10): 5637-5642.

M i y a s h i t a N.T. DNA variation in the 5' upstream region of the Adh locus of the wild plants Arabidopsis thaliana and Arabis gemmifera. Mol. Biol. Evol., 2001, 18(2): 164-171.

D o e b l e y J. Mapping the genes that made maize. Trends Genet., 1992, 8(9): 302-307.

P o t o k i n a E., B l a t t n e r F.R., A l e x a n d r o v a T. e.a. AFLP diversity in common vetch (Vicia sativa L.) on the world scale. Theor Appl Genet., 2002, 105: 58-67.

Z e l e n i n A.V., B a d a e v a E.D., M u r a v e n k o O.V. Introduction into plant genomics. Molecular Biology, 2001, 35(3): 285-293.

H a m r i c k J.K., G o d t M.J.W. Allozyme diversity in plant species /Eds. A.H.D. Brown, M.T. Clegg, A.L. Kahler e.a. In: Plant population genetics, breeding, and genetic resources. Sunderland, USA, 1990: 43-63.

К о н а р е в А.В., К о н а р е в В.Г., Г у б а р е в а Н.К. и др. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства. Цит. и ген., 2000, 34(2): 91-104.

W i l l i a m s J.G.K., K u b e l i k A.R., L i v a k K.J. e.a. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 1990, 18: 6531-6535.

W e l s h J., M c C l e l l a n d M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res., 1990, 18: 7213-7218.

R e i t e r R.S., W i l l i a m s J.G.K., F e l d m a n n K.A. e.a. Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random polymorphic DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 1477-1481.

C a r l s o n J.E., T u l s i e r a m L.K., G l a u b i t z J.C. e.a. Segregation of random amplified DNA markers in F₁ progeny of conifers. Theor. Appl. Genet., 1991, 83: 194-200.

P a r s o n s B.L., H e f l i c h R.H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res., 1997, 387(2): 97-121.

V o s P., H o g e r s R., B l e e k e r M. e.a. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res., 1995, 23: 4407-4414.

J e f f r e y s A.J., W i l s o n V., T h e i n S.L. Individual-specific «fingerprints» of human DNA. Nature, 1985, 316: 76-79.

W e i s i n g K., N y b o m H., W o l f f K. e.a. DNA fingerprinting in plants and fungi. Boca Raton, USA, 1995.

A k k a y a M.S., B h a g w a t A.A., C r e g a n P.B. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics, 1992, 132: 1131-1139.

E d w a r d s A., H a m m o n d H.A., J i n L. e.a. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups. Genomics, 1992, 12: 241-253.

B o t s t e i n D., W h i t e R.L., S k o l n i c k M. e.a. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32: 314-331.