Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количественных признаков у растений
Е.К. Потокина, Ю.В. Чесноков
На основе данных литературы рассматриваются современные принципы идентификации и картирования локусов количественных признаков (QTL) у растений. Дано краткое описание наиболее распространенных классов генетических молекулярных маркеров на уровне ДНК и принципов их использования для построения генетических карт. Изложена стратегия картирования QTL и клонирования генов, детерминирующих количественные хозяйственно ценные признаки у растений. Обсуждаются перспективы дальнейшего применения молекулярно-генетических методов исследования в практической генетике и селекции растений.
Modern methods of genomic analysis in investigations of quantitative determinants in plants (review)
E.K. Potokina, Yu.V. Chesnokov
S u m m a r y
On the basis of literature data the authors consider the modern principles of identification and mapping of loci of quantitative determinants (QTL) in plants. The short description of the most prevalence classes of genetic markers on the LNA level and their usage for genetic mapping were presented. The strategy of QTL mapping and gene cloning which are determined the quantitative economically valuable determinants in plants were considered. The ways of further usage of molecular-genetic methods in practice genetics and plants breeding were discussed. картирование генетический молекулярный маркер
Источником генетического разнообразия растений, как и других живых существ любого уровня организации, является полиморфизм нуклеотидной последовательности молекул ДНК, который уникален для любого индивидуума. Нуклеотидные вставки и делеции, а также точечные мутации определяют разнообразие аллелей большинства генов. К настоящему времени завершены несколько международных проектов по полному секвенированию геномов отдельных видов растений, в частности Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (ssp. japonica и ssp. indica) (1-3). Поскольку эти исследования проводили с использованием нескольких генотипов для каждого секвенируемого вида, появилась возможность приблизительно оценить частоту нуклеотидных замен в пределах вида. При сравнении геномных последовательностей у двух экотипов Arabidopsis (Landsberg и Columbia) выявлено 56000 нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) в последовательности ДНК (Cereon arabidopsis SNP collection; http//www.arabidopsis.org/cereon/). В результате анализа элитного генофонда кукурузы в США обнаружена примерно одна нуклеотидная замена на 48 пар нуклеотидов (п.н.) в некодирующих участках генома и на 131 п.н. в кодирующих локусах (4). В сложных геномах растений, таких, например, как кукуруза, 150 млн нуклеотидных сайтов являются полиморфными (5).
Накопленные факты позволяют судить не только об амплитуде изменчивости, выявляемой на уровне ДНК, но и об общих закономерностях ее проявления. Так, самоопыляющиеся виды характеризуются низкой степенью нуклеотидного полиморфизма (6-9). У видов культурных растений уровень полиморфизма ДНК значительно ниже, чем у их дикорастущих сородичей, так как при отборе определенных фенотипов культивируемые формы как бы проходят через «бутылочное горло» селекции (bottleneck-effect), что существенно снижает степень их изменчивости (10-11). Очевидно, что анализ и классификация огромного резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК и определяющего генетическое разнообразие культивируемых видов растений, является исключительно актуальным как для прикладной генетики, так и для селекции, так как часть этих нуклеотидных изменений в итоге определяет фенотипическую изменчивость.
Г е н о м и к а и с т р а т е г и я м о л е к у л я р н о г о м а р к и р о в а н и я. Анализ резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК в масштабе целого генома, начался в 1986 году после выявления полной нуклеотидной последовательности ДНК человека. В дальнейшем были секвенированы геномы дрожжей, дрозофилы, мыши и модельного объекта растений Arabidopsis thaliana. В результате успешного завершения этих исследовательских проектов сформировалась новая научная дисциплина -- геномика, призванная с помощью новейших технологий изучать геном живых организмов как единый целостный объект, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК. Предполагалось, в частности, что успех геномики растений, заключавшийся в расшифровке всей последовательности ДНК у Arabidopsis, привнесет революционные изменения в биотехнологию и селекцию растений. На практике выяснилось, что огромные размеры растительного генома (десятки миллиардов пар нуклеотидов), экстраординарное количество повторяющихся последовательностей и аллополиплоидия (присутствие в ядре нескольких родственных, но не идентичных геномов) реально позволяют осуществить полное секвенирование геномов только нескольких «модельных» видов растений, например Arabidopsis (125 тыс. п.н.) и риса (430 тыс. п.н.). Геномы других видов растений, вероятнее всего, придется анализировать с помощью сравнительной геномики (12) или на основе альтернативной технологии молекулярного маркирования. Суть последней состоит в следующем: если технически не представляется возможным полностью просеквенировать геном любого изучаемого организма, то можно приблизительно охарактеризовать генотипическую изменчивость индивидуумов на молекулярном уровне. С этой целью в последние десятилетия применяется стратегия молекулярных маркеров, которые своим присутствием обозначают (маркируют) полиморфизм в структуре макромолекул белков или ДНК. Первые работы в этой области были проведены с использованием изоферментов и запасных белков семян (13, 14). В последние десятилетия основное внимание генетиков было направлено на выявление полиморфизма макромолекул ДНК как непосредственного носителя наследственной информации.
Для оценки полиморфизма последовательности ДНК применяют разнообразные технические способы, и вопрос о различиях между молекулярными маркерами сводится, преимущественно, к различиям используемых технологий. Кратко остановимся на нескольких наиболее распространенных классах генетических молекулярных маркеров на уровне ДНК.
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Рестрикционные ферменты (эндонуклеазы) широко распространены среди прокариотов; их естественная функция заключается в разрушении инородных молекул ДНК посредством распознавания и разрезания специфических фрагментов нуклеотидной последовательности (длина рестрикционного сайта 4-6 п.н.) Каждый фермент имеет свой определенный сайт узнавания. Бактерии защищают собственную ДНК от воздействия эндонуклеаз посредством метилирования таких сайтов узнавания. Большое число разнообразных рестрикционных ферментов в настоящее время коммерчески доступно для использования при проведении лабораторного анализа. Разрезание молекулы ДНК рестрикционным ферментом позволяет получить набор ДНК-фрагментов различной, но строго определенной длины. Любые точечные мутации в сайте рестрикции, также как вставки или делеции, приводят к изменению длины рестрикционных фрагментов и фиксируются по изменению спектра последних при электрофорезе в ПААГ, что позволяет визуализировать ДНК-полиморфизм различных генотипов.
В связи с использованием рестрикционных фрагментов уместно упомянуть о создании библиотек фрагментов геномной и кодирующей ДНК. Фрагменты геномной ДНК, полученные в результате рестрикции ДНК изучаемого объекта эндонуклеазами, могут быть сохранены и размножены для дальнейшего изучения в биологических конструкциях, получивших название векторов. Например, с помощью существующих лабораторных методов клонирования нуклеиновых кислот фрагмент изучаемой ДНК может быть встроен в кольцевую цепь ДНК плазмиды бактериальной клетки. Далее быстрый рост бактериальной культуры обеспечит увеличение числа копий встроенных ДНК-фрагментов в тысячи раз в течение 1 сут. Использование бактериальных плазмид в качестве векторов позволяет размножать фрагменты ДНК длиной от 0,5 до 2 тыс. п.н. Другие типы векторов различаются по максимальным размерам встраиваемых фрагментов: космиды (cosmids, 40-50 тыс. п.н.), BACs (Bacterial Artificial Chromosome, несколько сотен тысяч пар нуклеотидов), YACs (Yeast Artificial Chromosomes, более 1 млн п.н.).
Коллекцию фрагментов геномной ДНК, размноженных с помощью специального вектора, называют геномной библиотекой. В принципе такая библиотека должна состоять из фрагментов всей ДНК, имеющейся в изучаемом объеме, включая кодирующие последовательности и «молчащие» (нетранскрибируемые) участки ДНК. Библиотеки, содержащие только кодирующие ДНК-последовательности (кДНК), создаются на основе выделенных из определенной ткани организма молекул информационной РНК (иРНК), которые ввиду нестабильности переводят в более устойчивую форму кДНК посредством обратной транскрипции. Последняя представляет собой синтез цепи ДНК на основе РНК-матрицы с помощью особого фермента вирусов -- обратной транскриптазы. Поскольку кДНК-библиотека создается на основе иРНК, реально выделенной из ткани изучаемого объекта, то содержит только фрагменты генов, функционирующих (экспрессируемых) в этой ткани и/или на определенной стадии развития организма.
Случайно амплифицированные полиморфные фрагменты ДНК (random amplified polymorphic DNAs, RAPDs). Использование полимеразной цепной реакции (предложена в 1985 году K. Mullis, получившим в 1993 году за это открытие Нобелевскую премию по химии) позволяет амплифицировать и проанализировать полиморфизм нуклеотидной последовательности любого представляющего интерес участка генома. Две группы ученых независимо друг от друга пришли к заключению, что воспроизводимые и наследуемые фрагменты ДНК могут быть амплифицированы с использованием одного короткого (обычно 10 нуклеотидов) праймера произвольного сиквенса (15, 16). Продукты амплификации разделяются в агарозном геле в соответствии с размером амплифицированных фрагментов, образуя специфический спектр. Полиморфизм фрагментов ДНК, амплифицированных неспецифическими праймерами, может быть обусловлен нуклеотидной заменой в цепи ДНК в участке «посадки» праймера, а также вставками или делециями внутри амплифицируемого участка полинуклеотидной цепи. Используя один и тот же праймер для анализа ДНК разных биологических видов, можно получить уникальный для каждого вида спектр ДНК-фрагментов, который практически всегда почти идентичен у всех особей одного вида, за исключением нескольких фрагментов, присутствующих у одного индивидуума и отсутствующих у другого. Показано, что такой полиморфизм наследуется и может быть использован как новый класс генетических молекулярных маркеров. Установлено также, что RAPD-маркеры можно с успехом использовать для построения генетических карт (17, 18).
CAPS-маркеры (cleavage amplified polymorphic segments). Одиночные нуклеотидные замены (SNPs) в цепи нуклеиновых кислот являются наиболее распространенной формой полиморфизма геномной ДНК (19). Прямым способом выявления точечных мутаций в цепи ДНК служит секвенирование определенного участка генома у некоторого числа индивидуумов. При этом необходимое условие -- это создание соответствующих праймеров на базе уже известных последовательностей прилежащих участков ДНК, информацию о которых можно получить из доступной базы данных интернета (например, GenBank Database; http://www.psc.edu/general/software/packages/genbank/genbank.html). С помощью праймеров амплифицируется фрагмент ДНК длиной обычно 400-700 п.н. Продукт ПЦР-реакции секвенируется для некоторой совокупности индивидуумов; таким образом выявляются участки цепи ДНК, где происходят нуклеотидные замены. Однако прочтение последовательности ДНК требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому для рутинного анализа большого числа проб обычно не используется. CAPS-маркеры позволяют отчасти решить эту техническую проблему, так как сочетают амплификацию изучаемого фрагмента ДНК и последующую обработку полученного ПЦР-продукта рестрикционным ферментом, который имеет в ДНК-фрагменте соответствующий сайт рестрикции, совпадающий с локусом нуклеотидных замен. Любая замена нуклеотида в участке рестрикции будет зафиксирована, так как этот фрагмент ДНК уже не может быть «разрезан» у индивидуумов с модифицированным рестрикционным сайтом.
Полиморфизм длин избирательно амплифицированных рестрикционных фрагментов (amplified fragments length polymorphism, AFLPs). Принцип метода заключается в следующем: исследуемую цепочку ДНК разрезают рестрикционными ферментами, затем короткие олигонуклеотидные фрагменты (адаптеры) присоединяют к концам рестрикционных фрагментов и проводят избирательную амплификацию последних с помощью праймеров, комплементарных к адапторам (20). Праймеры помимо последовательности, комплементарной к адапторной цепи, обычно несут на своем 3-конце один-три дополнительных селективных нуклеотида, что позволяет проводить избирательную амплификацию фрагментов, полностью комплементарных к последовательности праймера. При анализе сложного генома растительных организмов обычно применяют два цикла амплификации: в первом цикле (преамплификация) праймеры не содержат селективных нуклеотидов; во втором цикле продукт преамплификации используют в качестве матрицы для селективных праймеров. Продукты амплификации разделяют электрофорезом в ПААГ. Один из праймеров обычно метят радиоактивной или флюоресцирующей меткой, что повышает точность анализа.
Минисателлиты (variable number of tandem repeats, VNTR) и микросателлиты (simple sequence repeats, SSRs). В 1985 году впервые были открыты короткие повторы нуклеотидных пар (от 9 до 24 п.н.) в определенных участках генома человека, позднее названные минисателлитами (minisattelite repeats). В отличие, например, от маркеров RFLP, идентифицирующих нуклеотидные замены, полиморфизм минисателлитных маркеров основан на вставках или делециях в цепи ДНК. Этот класс молекулярных маркеров позволял идентифицировать геном отдельного индивидуума с беспрецедентной точностью. На основе использования минисателлитов была предложена стратегия ДНК-фингерпринтинга (DNA-fingerprinting), которая получила широкое применение в криминалистике, идентификации клеточных клонов и популяционной генетике (21). В дальнейшем методы выявления ДНК-полиморфизма совершенствовались, появлялись новые классы маркеров, однако термин «ДНК-фингерпринтинг» закрепился в научной литературе, хотя в настоящее время под ним могут подразумеваться и молекулярные маркеры, не являющиеся эффективными для идентификации отдельных особей (22).
Микросателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности ДНК, но более короткие, чем минисателлиты: двух-, трех-, четырехнуклеотидные. Число таких повторов настолько вариабельно, что позволяет выявлять изменчивость последовательности ДНК у таких облигатных самоопылителей, как, например, соя, в то время как RAPD-маркерами такой полиморфизм выявить не удается (23). Столь высокий полиморфизм длины микросателлитных повторов обусловливают неполная репликация или неравный кроссинговер (24).