Использование молекулярных маркеров позволяет фиксировать между индивидуумами многочисленные генетические различия, которые не проявляются в фенотипе. В этой связи целый ряд ДНК-маркеров из перечисленных выше широко применяют для построения генетических карт у растений различных видов. Ранее возможности по картированию генов зависели исключительно от синтетических популяций, насыщенных морфологическими маркерами, которые обычно представляют собой макромутации (например короткие крылья или красная окраска глаз у дрозофилы) и в естественных популяциях встречаются редко. Полиморфизм, обнаруживаемый на уровне ДНК, предоставляет практически неограниченное число ДНК-маркеров, которые могут быть проанализированы в любой картируемой популяции.
П о с т р о е н и е г е н е т и ч е с к и х к а р т н а о с н о в е м о л е к у л я р н ы х м а р к е р о в. Первая генетическая карта, основанная на полиморфизме молекулярных RFLP-маркеров, была сконструирована в 1980 году; ее использовали для локализации генов, кодирующих преимущественно качественные признаки (как и карты, полученные с помощью методов классической генетики) (25). В дальнейшем генетические карты на базе молекулярных маркеров стали широко применять и для анализа изменчивости фенотипических количественных признаков (26). Генетические карты конструируются на основе анализа частоты рекомбинации аллелей молекулярных маркеров в потомстве от скрещивания двух родительских генотипов, между которыми выявлен полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК. Маркеры, которые маркируют полиморфные генетические локусы, могут располагаться на разных хромосомах или в разных позициях на одной и той же хромосоме (в непосредственной близости друг от друга или на разных ее концах). От взаимного расположения двух маркеров относительно друг друга зависит вероятность рекомбинации между ними в процессе кроссинговера, которая прямо пропорциональна дистанции между ними.
На рисунке 1 представлена схема картирования генетического локуса на примере гена Cxp 1 в расщепляющейся популяции от скрещивания двух элитных североамериканских сортов ячменя -- Steptoe (высокобелковый сорт, используемый в пищевой промышленности) и Morex (один из наиболее востребованных в пивоварении). Ген Cxp1 кодирует протеолитический фермент карбоксипептидазу, имеющий важное значение в технологии пивоварения (27). Этот фермент расщепляет запасные белки в прорастающем семени ячменя, то есть обусловливает формирование солода.
8
Рис. 1. Схема построения генетической карты с использованием полиморфизма молекулярных маркеров на примере 3Н-хромосомы ячменя: а -- полиморфизм нуклеотидной последовательности гена
Cxp1, выявленный с помощью CAPS-маркера у растений 19 (из 150) линий двойных гаплоидов, полученных от скрещивания сортов Steptoe (аллель А) и Morex (аллель В); б -- расщепление аллелей 32 маркеров у тех же линий (цит. по 28); в -- расположение молекулярных маркеров с помощью компьютерной программы MAPMAKER V. 2.0 в наиболее вероятном линейном порядке (относительно друг друга) на расстоянии, пропорциональном наблюдаемой частоте рекомбинации между ними. картирование генетический молекулярный маркер
На основе гибридов F1 от скрещивания сортов Steptoe и Morex биотехнологическими методами in vitro было создано 150 линий двойных гаплоидов, каждая из которых несла в любом полиморфном локусе одной из родительских форм аллель, который легко идентифицировать. В изучаемом гене была также обнаружена нуклеотидная замена, визуализированная с помощью CAPS-маркера (рис. 1, а). Обозначив родительские аллели сортов Steptoe и Morex соответственно как А и В, можно записать полученные данные в доступном для математического анализа виде (см. рис. 1, б). Учитывая, что не один, а как минимум 295 генных локусов, выявленных преимущественно с помощью RFLP-маркеров, оказываются полиморфными при сравнении родительских генотипов (28), можно полагать, что в рассматриваемом примере представлены весьма репрезентативные данные о том, насколько сцепленно наследуется полиморфизм маркерных локусов в 150 линиях двойных гаплоидов. В дальнейшем задача компьютерных программ состоит в подсчете частоты рекомбинаций между всеми возможными парами маркеров и выявлении групп сцепления, внутри которых маркеры должны быть расположены в наиболее вероятном линейном порядке: на расстоянии друг от друга, пропорциональном наблюдаемой частоте рекомбинаций между ними (см. рис. 1, в).
Молекулярное маркирование как инструмент для анализа изменчивости количественных признаков. Большинство фенотипических признаков, представляющих интерес для селекции, является количественными и контролируется алеллями нескольких генетических локусов. Согласно теории эколого-генетической организации сложных полигенных признаков растений, частота встречаемости генов, детерминирующих средние показатели и генетическую дисперсию количественного признака, зависит от лимитирующих факторов внешней среды (29). Смена лимитирующих факторов влечет за собой также смену спектра генетических локусов, определяющих фенотипическую изменчивость признака. Тем не менее предполагается существование отдельных ключевых генов, которые при любых условиях привносят свой вклад в формирование конкретного количественного признака, хотя доля этого вклада регламентируется внешней средой (30). Такие генетические локусы обозначены термином QTL (quantitative trait loci); они представляют основной интерес при использовании молекулярного подхода к селекции полигенных признаков, в том числе так называемого «marker assisted selection» (MAS) -- маркерной помощи отбору. Одна из задач этого научного направления состоит в идентификации, изучении, картировании и клонировании QTL, оказывающих влияние на варьирование фенотипических признаков (31).
П р и н ц и п ы и д е н т и ф и к а ц и и и к а р т и р о в а - н и я QTL. Поиск методов, с помощью которых удалось бы каким-либо образом идентифицировать QTL или обнаружить закономерность их проявления, имеет давнюю историю. В 1923 году Sax опубликовал результаты исследования, свидетельствующего о достоверной корреляции между размерами семени фасоли (количественный полигенный признак) и типом пигментации семенной кожуры (дискретный моногенный признак) (32). Данные были интерпретированы как сцепленное наследование гена, ответственного за окраску семени, с одним или несколькими генами, определяющими изменчивость количественного признака -- размера семени. Идея использовать в качестве маркеров дискретные моногенные морфологические признаки для систематического выявления генов, контролирующих изменчивость количественного признака, была окончательно сформулирована Thoday (33). Осуществить это на практике оказалось затруднительным, так как для большинства организмов известны лишь немногие моногенно расщепляющиеся морфологические признаки. Даже если таковые и были описаны, то в очень редких случаях они наследовались сцепленно с изучаемым количественным признаком.
Началом эры использования молекулярных маркеров в генетических исследованиях послужили первые работы по оценке полиморфизма изоферментов и запасных белков семян (34, 35). Аллельные формы ферментов (изоферменты) могут быть разделены электрофорезом в ПААГ. При этом можно оценить аллели генов, кодирующие ферменты в естественных популяциях, и локализовать их на генетических картах независимо от того, насколько явно полиморфизм этих аллелей отражался на фенотипе (36). В начале 80-х годов прошлого столетия изоферментные маркеры были главным инструментом для картирования полигенных признаков и являлись гораздо более эффективными, чем морфологические маркеры, которые также использовали для этой цели (37). Тот факт, что изменчивость количественных фенотипических признаков может быть ассоциирована со специфическим молекулярным маркером, впоследствии был подтвержден в многочисленных экспериментальных исследованиях (38, 39).
К основным преимуществам ДНК-маркеров по сравнению с морфологическими и изоферментными маркерами относятся следующие: фенотипическая нейтральность, так как большинство ДНК-маркеров локализовано в некодирующих участках генома; высокий уровень полиморфизма за счет отсутствия естественного отбора в популяции (в связи с фенотипической нейтральностью) и высокой частоты мутирования; кодоминантный характер наследования, что позволяет с уверенностью распознать не только гомозиготные рецессивные генотипы, но также и гетерозиготные; отсутствие эпистатического эффекта (31).
Картирование локусов количественных признаков (QTL) с использованием любого типа маркеров проводят на основе следующих принципов: если расщепление по маркерному признаку достоверно коррелирует с изменением изучаемого количественного признака, то предполагается, что локус маркерного гена сцепленно наследуется с одним (или несколькими) QTLs количественного признака, как правило, благодаря близкому расположению гена-маркера и гена (генов) QTL на хромосоме. Следовательно, картируя ген-маркер, можно приблизительно локализовать прилежащий к нему QTL-локус. Если количество маркеров, сцепленных с полигенным признаком, велико и они более или менее равномерно распределены по геному, то реально выявить практически все участки генома, где локализованы QTLs, привносящие вклад в детерминацию оцениваемого фенотипического признака.
С т р а т е г и я к а р т и р о в а н и я QTL. Для построения генетической карты и идентификации QTL необходимо искусственно создать популяцию, представляющую собой потомство от возвратного скрещивания, скрещивания гибридов F2 и F3, удвоенно-гаплоидное потомство F1 или рекомбинантные имбредные линии (40). Цель создания такой популяции -- получить возможно большее число гомозиготных линий для определения частоты рекомбинаций между отдельными генетическими локусами в расщепляющейся популяции. В качестве исходной родительской пары подбирают генотипы, наиболее контрастные по изучаемому фенотипическому признаку. Экспериментальную популяцию насыщают возможно бульшим числом молекулярных маркеров, образующих группы сцепления, картируемые на хромосомах. Далее экспериментальную популяцию разделяют на два генотипических класса (гомозиготные линии одного класса несут аллель материнской, другого класса -- отцовской формы) и затем оценивают различия между средними показателями фенотипического признака у представителей этих классов. Если разница достоверна, делается заключение, что ген, влияющий на проявление конкретного фенотипа, сцеплен с молекулярным маркером, использовавшимся для подразделения популяции на два упомянутых класса. Процедуру повторяют поочередно с каждым маркером, картированным для исследуемой популяции, с тем чтобы выявить все возможные маркеры, ассоциированные с QTL.
Одним из классических примеров QTL-анализа является картирование генетических локусов, детерминирующих пивоваренные свойства у ячменя (41). Эта работа была выполнена на основе уже упомянутой экспериментальной популяции, полученной от скрещивания двух сортов ячменя (Steptoe и Morex), контрастных по пивоваренным качествам. При этом 295 полиморфных RFLP-маркеров были картированы на семи хромосомах, в результате чего общая длина хромосом составляла около 1250 сМ и на них располагались RFLP-маркеры, отстоящие друг от друга в среднем на 4,2 сМ. Эту генетическую карту использовали для картирования QTL-локусов, контролирующих важнейшие агрономические и пивоваренные признаки растений ячменя. На рисунке 2 продемонстрирован пример картирования генетических локусов растений ячменя (QTL), которые достоверно влияют на активность ферментов, необходимых для солодования (Diastatic Power). Достоверность такой корреляции оценивают на основе порогового значения так называемого LOD-score (logarithm of odds), который в упрощенном варианте представляет собой десятичный логарифм вероятности того, что неверна нуль-гипотеза, по которой между двумя классами рекомбинантных линий, несущих отцовский (АА) и материнский (аа) аллель, нет достоверных фенотипических различий (42, 43). Так, LOD = 2, LOD = 3 (и т.д.) означает, что гипотеза, альтернативная нулевой, является в 102-103 раз (и т.д.) более вероятной. В большинстве исследований пороговым значением принято считать LOD = 3 (42). Как следует из рисунка 2, в геноме ячменя можно выявить три наиболее вероятных участка хромосом 1Н, 4Н и 7Н, где, предположительно, локализованы гены, контролирующие активность ферментов, необходимых для солодования.
Изложенная стратегия картирования QTL имеет свои ограничения: идентифицируют преимущественно QTL-локусы, определяющие наибольшую долю фенотипической изменчивости; гены, привносящие меньший вклад в детерминирование фенотипической изменчивости, распознаются только в редких случаях, при условии, что экспериментальная популяция достаточно велика (более 500 особей) (31). Доля изменчивости количественного признака, которая может быть объяснена обнаруженным QTL, в разных исследованиях варьирует от 5 до 74 % (44). Остается неизвестным, каким образом трактовать оставшуюся долю фенотипической изменчивости: необнаруженными малыми QTL или воздействием внешней среды (45). Наиболее существенным недостатком метода является его низкое разрешение.
Длина фрагмента хромосомы, где локализован статистически рассчитанный QTL, в большинстве случаев составляет 5-10 сМ, что в случае, например, генома кукурузы эквивалентно 10-20 млн п.н. (несколько сотен возможных генов) (5). Тем не менее для селекции эти недостатки могут не иметь большого значения. Исследователей, как правило, интересуют QTL с наибольшим влиянием на фенотип, и знание точной локализации QTL на коротком участке хромосомы не является обязательным с практической точки зрения.
Рис. 2. Схема картирования генетических локусов (QTL) линий двойных гаплоидов ячменя, контролирующих активность ферментов, необходимых для солодования (цит. по 41) на основе интервального метода: 1Н-7Н -- семь хромосом ячменя; пунктиром обозначено пороговое значение LOD = 3 (локусы, соответствующие пикам кривых над пороговым значением LOD, рассматриваются как достоверно вовлеченные в формирование фенотипического признака); девять кривых в пределах каждой хромосомы соответствуют девяти независимым замерам фенотипического признака в экспериментальной популяции растений ячменя, выращенных в разных географических пунктах. Максимальное значение LOD для хромосом 1Н, 2Н, 3Н, 4Н, 5Н, 6Н и 7Н составляет соответственно 6,43; 4,51; 1,20; 6,27; 3,11; 1,92 и 4,23.
Если селекционер заинтересован в улучшении некоторого признака в элитных линиях, с которыми он работает, то соответствующий участок хромосомы с аллелями QTL, обусловливающими желательный фенотипический эффект, может быть интрогрессирован от донора, несущего эти аллели. Как только с помощью ДНК-маркеров такой донор будет выявлен, появляется возможность скрестить его с элитной линией и осуществить серию возвратных скрещиваний, отбирая каждый раз потомков, которые несут в своем геноме нужный аллель QTL во внедряемом хромосомном сегменте (46). Каждый раз присутствие желаемого аллеля будет фиксироваться с помощью близлежащих сцепленно наследуемых ДНК-маркеров. Создание таких улучшенных инбредных линий с использованием информации о картированных QTL для двух элитных расщепляющихся популяций сахарной кукурузы был описан Edwards с соавт. (47). Эти линии были усовершенствованы по 34 фенотипическим признакам только на основе данных молекулярного маркирования.