Статья: Состояние антиоксидантной системы в митохондриях клеток кожи при росте экспериментальной меланомы B16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Состояние антиоксидантной системы в митохондриях клеток кожи при росте экспериментальной меланомы B16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли

Франциянц Е.М., Нескубина И.В.,

Сурикова Е.И., Трепитаки Л.К.,

Немашкалова Л.А., Каплиева И.В., Лесовая Н.С.

г. Ростов-на-Дону, Россия

Резюме

Цель - изучить состояние антиоксидантной системы в митохондриях клеток кожи при росте меланомы B16/F10 у мышей на фоне хронической нейрогенной боли.

Материалы и методы. Работа выполнена на самках мышей линии C57BL/6 (п = 28). Экспериментальные группы: интактная, контрольная - воспроизведение модели хронической нейрогенной боли, группа сравнения - стандартная подкожная перевивка меланомы B16/F10, основная группа - перевивка меланомы B16/F10 через 3 нед после создания модели хронической нейрогенной боли.

Животных на 14-е сут роста меланомы B16/F10 декапитировали, иссекали кожу, выделяли митохондрии. Тест-системой для иммуноферментного анализа определяли уровень восстановленного глутатиона (GSH), окисленного глутатиона (GSSG) (Bio Source, США); глутатионпероксидазы-4 (ГПО-4) (Clod-Clon Corporation, CNDR); глутатионредуктазы (ГР) (Cusabio, CNDR); глутатион-S-трансферазы (ГТ) (Ivvundiagnostik, Германия); глутатионпероксидазы-1 (ГПО-1), супероксиддисмутазы-2 (СОД-2) (Ab Frontier, Южная Корея).

Результаты. В митохондриях клеток кожи в контрольной группе установлено повышение содержания GSH в 1,3 раза; ГПО-1 - 2,9; ГПО-4 - 1,9; ГР - 2,8; СОД-2 в 2,4 раза относительно значений у интактных животных. В группе сравнения обнаружили принципиально противоположные изменения: снижение содержания ГПО-1 в 1,9 раза; ГПО-4 - 3,7; ГР - 3,9; СОД-2 в 3,8 раза и повышение уровня GSSG в 1,36 раза по сравнению со значениями у интактных животных.

При росте меланомы на фоне хронической нейрогенной боли отмечено увеличение уровня GSH в 1,5 раза; ГПО-1 - 3,6; ГТ - 1,28; ГПО-4 - 1,6 и СОД-2 в 1,8 раза по сравнению со значениями в интактной группе животных.

Заключение. При росте меланомы B16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли происходит перестройка антиоксидантной системы митохондрий клеток кожи в сторону реализации «восстановительного стресса» под воздействием хронической боли, что может оказывать влияние на рост и развитие экспериментальной меланомы.

Ключевые слова: экспериментальная меланома B16/F10, хроническая нейрогенная боль, кожа, антиоксидантная система, митохондрии.

Abstract

State of the antioxidant system in mitochondria of skin cells during experimental B16/F10 melanoma growth with chronic neurogenic pain

Frantsiyants E.M., Neskubina I.V., Surikova E.I., Trepitaki L.K., Nemashkalova L.A., Kaplieva I.V., Lesovaya N.S. Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation

Aim. To study the state of the antioxidant system in mitochondria of skin cells during B16/F10 melanoma growth in mice with chronic neurogenic pain.

Materials and methods. The study included female C57BL/6 mice (n = 28). Experimental groups included an intact group, a control group - chronic neurogenic pain model, a comparison group - standard subcutaneous transplantation of B16/F10 melanoma, and a main group - transplantation of B16/F10 melanoma 3 weeks after creation of a model of chronic neurogenic pain. Animals were decapitated on day 14 of the B16/F10 melanoma growth, the skin was excised and mitochondria were isolated.

Standard ELISA test systems were used to determine the levels of reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) (Bio Source, USA); glutathione peroxidase-4 (GPx 4) (Clod-Clon Corporation, CNDR); glutathione reductase (GR) (Cusabio, CNDR); glutathione S-transferase (G-S-T) (Ivvundiagnostik, Germany); glutathione peroxidase-1 (GPx 1), and superoxide dismutase-2 (SOD-2) (Ab Frontier, South Korea).

Results. Mitochondria of skin cells in controls showed an increase in the levels of GSH by 1.3 times, GPx 1 - by 2.9 times, GPx 4 - by 1.9 times, GR - by 2.8 times, and SOD-2 - by 2.4 times, compared to intact animals. Changes in the comparison group were opposite: GPx 1 decreased by 1.9 times, GPx 4 - by 3.7 times, GR - by 3.9 times, SOD-2 - by 3.8 times, and GSSG rose by 1.36 times compared to intact animals.

The growth of melanoma with chronic neurogenic pain caused an increase in the levels of GSH by 1.5 times, GPx 1 - by 3.6 times, G-S-T - by 1.28 times, GPx 4 - by 1.6 times, and SOD-2 - by 1.8 times, compared to intact animals.

Conclusions. The growth of B16/F10 melanoma together with chronic neurogenic pain restructures the antioxidant system of skin mitochondria towards generation of reductive stress under the influence of chronic pain, which can affect the growth and development of experimental melanoma.

Key words: experimental B16/F10 melanoma, chronic neurogenic pain, skin, antioxidant system, mitochondria.

Введение

Меланома кожи характеризуется крайне высокой степенью злокачественности и необычайно большим потенциалом метастазирования, которое происходит лимфогенным, гематогенным и лимфогематогенными путями.

Традиционно меланома кожи считается опухолью с вариабельным, часто непредсказуемым, клиническим течением, в том числе как с наличием случаев спонтанной регрессии первичного опухолевого очага, так и ранней генерализацией опухолевого процесса при наличии благоприятных прогностических признаков [1].

В последние годы достигнуты определенные успехи в понимании этиологии данного заболевания, которая связана с анатомической локализацией, степенью воздействия ультрафиолетового излучения, генетическими особенностями и потенциально другими факторами [1, 2].

Любой патологический процесс на момент очевидной значимости проходит начальную перестройку на сверхтонком уровне. Грань перехода от нормы к патологии требует досконального изучения на атомно-молекулярном и субклеточном уровне [3].

Способность адаптировать клеточные биоэнергетические возможности под влиянием быстро меняющихся условий окружающей среды является обязательной как при нормальной клеточной функции, так и при развитии опухолей [4].

Высокочувствительными индикаторами возникновения в организме патологических процессов являются митохондрии. Они, являясь центральной метаболической органеллой, выполняют «критические» биохимические функции в синтезе основных клеточных компонентов, включая жирные кислоты, аминокислоты и нуклеотиды.

Клетки многих опухолей, содержащие полностью функциональные митохондрии, для поддержания пролиферации и выживания увеличивают скорость гликолиза, обеспечивая повышенный поток субстрата для биосинтетических путей, частично осуществляемых в митохондриях (метаболизм глюкозы и липогенез, метаболизм аминокислот и биосинтез нуклеотидов).

В результате активации метаболического потока через митохондриальные пути повышается связанное с этим производство активных форм килорода (АФК) в опухолевых клетках, что влечет за собой активацию путей антиоксидантного ответа клеток [4].

Органом-мишенью для меланомы часто служит кожа, являющаяся уникальным и самым большим органом (тканью) тела, концентрирующим в себе множество физиологических функций. Кожа является ключевым интерфейсом между эндокринной, нервной и иммунной системами, представляющим собой самостоятельный орган.

Кожа - это целостная, сложно устроенная тканевая система, включающая в себя несколько слоев, которые находятся в тесной связи между собой.

В коже сконцентрированы кровеносные, лимфатические и нервные пути, которые позволяют быстро реагировать на болевые, механические, химические, термические и другие раздражения, отвечая сужением или расширением просвета с последующим изменением кровотока.

На тонус (ширину просвета кровеносных сосудов, скорость кровотока) кровеносной сети кожи влияет кора головного мозга через многочисленные сосудосуживающие и сосудорасширяющие нервные окончания, благодаря которым реализуется возможность организма чувствовать тепло, холод, давление, осязание, а также боль [5].

Боль часто является сопровождающим компонентом опухолевого процесса и присутствует у 30-50% онкологических больных после проведения противоопухолевой терапии, у 65-90% пациентов в связи с прогрессированием заболевания [6].

Происхождение боли у онкологических больных, как правило, многофакторное: прямые и косвенные эффекты роста опухоли, побочное действие противоопухолевой терапии, сопутствующие заболевания [6].

Экспериментальная онкология движется в сторону понимания биологических и физиологических процессов, происходящих в организме в случае сопутствующей хронической боли при опухолевой болезни. Показано, что хроническая нейрогенная боль является стимулятором и модификатором роста злокачественной меланомы кожи в эксперименте [7].

В связи с вышесказанным весьма актуальным представляется изучение антиокислительных процессов в митохондриях клеток кожи при патологических процессах, сопровождаемых болевым синдромом. Бесспорно, изучение патофизиологических процессов возможно через применение экспериментальных моделей.

Неоспорим тот факт, что развитие экспериментальной онкологии с углубленным изучением патофизиологии злокачественного процесса на экспериментальных моделях животных способствует совершенствованию практической и теоретической составляющей такого глобального направления в медицине, как онкология.

Цель исследования - изучить антиокислительную систему в митохондриях клеток кожи экспериментальных животных на фоне хронической нейрогенной боли, опухолевого процесса и сочетанного воздействия данных патологических процессов.

Материалы и методы

Работа выполнена на самках мышей линии С57ВL/6 (п = 28) 8-недельного возраста с начальной массой 21-22 г. Животные были получены из ФГБУ МНИЦ Научный центр биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Московская область).

В работе использовали клеточную линию мышиной меланомы В16/Б10, метастазирующую в легкие. Опухолевый штамм получен из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Исследования на животных проводились с соблюдением принципов гуманности, которые изложены в Директиве Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Животные были распределены методом случайной выборки на следующие экспериментальные группы: интактная группа (п = 7), контрольная группа с воспроизведением модели хронической боли [8] (п = 7), группа сравнения (В16/Д10) - мыши со стандартной подкожной перевивкой меланомы В16/Р10 (п = 7) и основная группа (хроническая боль + В16^10) - мыши, которым меланому В16/Д10 перевивали через 3 нед после создания модели хронической боли (п = 7).

Мышам основной группы (хроническая боль + В16/Б10) осуществляли перевязку седалищного нерва с двух сторон под ксила-золетиловым наркозом. Через 3 нед после заживления операционной раны подкожно под правую лопатку вводили 0,5 мл взвеси опухолевых клеток меланомы В16/Б10 в физиологическом растворе в разведении 1 : 10.

Животным из группы сравнения (В16/Б10) перевивали меланому В16/Б10 подкожно в той же дозе и объеме, что и в основной группе, но без воспроизведения модели хронической боли.

При стандартной перевивке опухоль появляется в 100% случаев, достаточно быстро растет и на 12-16-е сут роста метастазирует преимущественно гематогенно в легкие (60-90%), реже - в печень и селезенку. Все манипуляции с животными производили в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицировали общепринятым способом.

Всех животных через 2 нед (14-е сут) эксперимента декапитировали на гильотине. После декапитации у животных с применением хладагентов быстро иссекали кожу и выделяли митохондрии по методу М.В. Егоровой, С.А. Афанасьева [9]. В полученных митохондриальных образцах с помощью стандартных тест-систем иммуноферментного анализа определяли уровень восстановленного глутатиона (GSH), нМ/г белка (Bio Source, США); окисленного глутатиона (GSSG), нМ/г белка (Bio Source, США); глутати- онпероксидазы-1 (ГПО-1), нг/мг белка (Ab Frontier, Южная Корея); глутатионпероксидазы-4 (ГПО-4), нг/мг белка (Clod-Clon Corporation, CNDR); глутатион-редуктазы (ГР), нг/мг белка (Cusabio, CNDR); глутатион-S-трансферазы (Г-S-T), нг/мг белка (Ivvundiagnostik, Германия); супероксиддисмутазы-2 (СОД-2), пг/мг белка (Ab Frontier, Южная Корея); общего белка биуретовым методом, г/л (Ольвекс Диагностикум, Россия).

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Сравнение количественных данных в четырех группах (независимые выборки) проводили с использованием критерия Краскела - Уоллиса с процедурой множественных сравнений. Данные таблиц представлены в виде M ± m, где M - среднее арифметическое значение, а m - стандартная ошибка среднего.

Результаты

В ходе эксперимента были получены данные по влиянию меланомы B16/F10, хронической нейрогенной боли и сочетанного воздействия данных патологических процессов на глутатионовую систему в митохондриях клеток кожи мышей-самок на 14-е сут эксперимента - логарифмическая фаза роста экспериментальной опухоли (табл. 1).

Таблица 1

Содержание антиоксидантных ферментов в митохондриях клеток кожи мышей-самок при росте меланомы В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли, M ± m