РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОГО СОСТАВА ЗАЩИТНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ РОДА BACILLUS
DEVELOPMENT OF OPTIMAL COMPOSITION OF A PROTECTIVE MEDIUM FOR LYOPHILIZATION OF BACTERIOPHAGES GENUS BACILLUS
Гранкина А.С., Золотухин С.Н., Молофеева Н.И.
Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия
имени П.А. Столыпина, Россия
Аннотация
Статья посвящена изучению готовых защитных сред и разработке новых стабилизаторов. Нами предложены новые комбинации компонентов для высушивания бактериофагов рода Bacillus.
Ключевые слова: стабилизатор, компоненты, криопротекторы, бактериофаг, защитные свойства, высушивание, выживаемость.
Из ряда факторов, оказывающих влияние на выживаемость бактериофагов в процессе высушивания, наиболее важную роль играет состав среды, применяемой для изготовления суспензии фагов [4,12,13].
Чтобы снизить воздействие множества повреждающих факторов в процессе замораживания биологических структур экспериментальным путем, были подобраны так называемые защитные вещества, или криопротекторы [3,4,11]. Защитные среды должны отвечать следующим критериям:
- сохранять жизнеспособность, морфологические, биохимические, таксономические и генетические свойства биологических структур в процессе консервации и хранения;
- быть нетоксичными;
- иметь хорошую растворимость в воде;
- легко соединяясь с водой, выполнять колигативные функции;
- иметь низкую температуру эвтектики;
- предотвращать гиперконцентрирование солей в суспензии;
- стабилизировать водородные связи в кристаллической решетке и предотвращать формирование больших кристаллов льда;
- хорошо проникать в клетки (только внутриклеточный механизм криопротекции).
Криопротекторы, согласно точке приложения их действия, разделены на две группы:
1. Внутриклеточные криопротекторы - среды, проникающие в клетки.
2.Внеклеточные криопротекторы - среды, соединяющиеся с внеклеточной водой.
Однако в силу огромного разнообразия встречающихся в природе микроорганизмов, бактериофагов одним криопротектором в практической работе не обходятся. Поэтому при криоконсервации новых бактериальных штаммов следует предварительно проверить действие на них различных типов криопротекторов и выбрать подходящий для условий их последующего хранения [1,2,10].
Применяемые в настоящее время среды высушивания характеризуются огромным разнообразием своего состава. Используются вещества, совершенно различные по своей химической природе,- от неорганических солей до сложных органических соединений и естественных биологических субстратов. Большое распространение получили комбинированные среды высушивания, состоящие из нескольких компонентов [5,6].
Эффективная защитная среда должна предохранять бактериофаги от необходимых изменений, как в процессе замораживания, так и при последующем хранении сухих препаратов при неблагоприятных внешних условиях.
Среды высушивания включают в основном три группы веществ:
1) естественные биологические субстраты и продукты их переработки (сыворотка, молоко, бульон, пептон и др.);
2) углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза и др.), которые оказались способными защищать микроорганизмы при высушивании и хранении в условиях умеренных температур;
3) вещества, обладающие защитными свойствами не только в процессе высушивания, но и при относительно высоких температурах хранения сухих препаратов (аминокислоты, глютамат натрия и др.) [1,10].
Из жидкостей биологического происхождения хорошими свойствами обладает обезжиренное молоко. Защитные свойства молока выявлены при высушивании вирусов. Так же одним из лучших стабилизаторов при высушивании вирусов является сахарозножелатиновая среда [2,7,8].
Декстран - это вещество хорошо известно в медицине в качестве заменителя плазмы крови. Декстран также применяется как криопротектант для сохранения микроорганизмов и вирусов. Декстран химически инертен и поэтому может быть использован в смеси с другими криопротекторами в составе многокомпонентных защитных сред [3]. Для криоконсервации и лиофилизации микроорганизмов применяются, например, различные сахариды (сахароза, глюкоза, трегалоза), коллоиды (желатин, агар, пептон, молоко и сыворотки), соли (глутамат натрия) и т.д. Так, использование композитных защитных сред, как показывают экспериментальные исследования и практический опыт, обеспечивает более высокую жизнеспособность микробных клеток и фагов в процессе консервации и последующего хранения по сравнению с простыми защитными средами. В практической работе более 60 лет используется ставшая хорошо известной специалистам по лиофилизации сахарозо- желатиновая защитная среда (сахароза 10 % + желатин 1 %). Другие защитные среды, включающие, например, пептон (0,1-10 %), сахарозу (10 %), лактозу (10 %), трегалозу (10 %), обезжиренное молоко (10-20 %), натрия глутамат (5 %), гидролизат казеина и многие другие вещества, успешно применяются для консервации рода Bacillus и многих других.
При выборе защитной среды необходимо учитывать, что в ряде случаев ее эффективность будет зависеть от применяемого режима замораживания и высушивания суспензии [2,13].
В работе были использованы два референс-штамма бактерий, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарносанитарной экспертизы Ульяновской ГСХА: B.cereus №96, B.mycoides H.
Штаммы фагов: FBс №96 и FBmyc H.
Питательные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, полужидкий агар. Сухое обезжиренное молоко ГОСТ Р 52791-2007, сахароза, дрожжевой экстракт, лактоза, сорбит, желатин пищевой ГОСТ 11293-89, инозит.
По отзывам и рекомендациям из литературы, нами были подобраны компоненты и составлены среды для высушивания. Среды 1 и 2 были придуманы нами, исходя из множества просмотренных вариаций. Стабилизаторы 3 и 4 уже проверены на опытах высушивания вирусов, но именно для лиофилизации бактериофагов рода Bacillus нами данные не были найдены. Исходя из этого, мы решили взять готовые среды для высушивания и проверить их действие.
Стабилизаторы:
1. Сухое обезжиренное молоко (9%), лактоза (5%), сахароза (5%).
2. Дрожжевой экстракт (3%), сахароза (2%).
3. Лактоза (1%), сорбит (1%), сахароза (3%), желатин (2%), дрожжевой экстракт (1%).
4. Сухое обезжиренное молоко (14%), инозит (5%).
Рассмотрим некоторые компоненты, используемые для приготовления стабилизаторов. Сухое обезжиренное молоко содержит в своем составе большой процент белков и молочного сахара.
Основными компонентами дрожжевого экстракта являются продукты распада белков (пептиды, свободные аминокислоты) и нуклеотиды, а также он богат витаминами группы B (B1, B2, B6, B3, B7, B9, B5).
Желатин - его основа-это белок и аминокислоты.
Все компоненты безвредны для бактериофагов и способствуют их сохранности, они проверены на опытах, только в других вариациях.
Компоненты для каждой среды смешивали в 100 мл дистиллированной воды, и растворяли на кипящей водяной бане (чтобы избежать подгорание компонентов). Стерилизацию проводили автоклавированием при 0,5 атм в течение 25-30 минут. Готовые среды хранили в холодильнике при температуре не выше 10°C. Приготовленные стабилизаторы можно использовать при высушивании бактериофагов (рис.1).
лиофилизация бактериофаг bacillus криоконсервация
Рисунок 1 - Защитные среды (стабилизаторы)
После высушивания и запайки ампул смотрели внешний вид препарата.
1. Окраска сухого препарата равномерная.
2. Сокращение объема, по сравнению с исходными ампулами перед высушиванием, не наблюдали.
3. Содержимое всех ампул с высушенным материалом хорошо растворялось.
4. Появление пузырьков на поверхности материала, как результат наличия в замороженной массе некоторого количества жидкости, не наблюдали.
5. Крупную неравномерную пористость видели в стабилизаторе под номером 2 всех высушенных ампул.
6. Плохое отставание сухой массы от стенок ампулы было проявлено в стабилизаторах под №2, а так же в некоторых ампулах с бактериофагом FBс №96 в среде №3.
Фаг FBс №96 проявил наибольшее количество выживших фаговых частиц 66,7% после высушивания с первым стабилизатором. По внешнему виду о препарате можно сказать, что он имел равномерную окраску, отставание от стенок ампулы было хорошим, таблетка образовывалась, содержимое отлично растворялось.
Наименьший титр фага был при высушивании со стабилизатором под №3 - 8% выживших частиц. Цвет содержимого ампулы был равномерным, но таблетки мы не наблюдали.
В результате мы может предположить, что наибольшую выживаемость на бактериофаг FBс №96 оказывают сухое обезжиренное молоко и сахара, конкретно сахароза и лактоза.
Фаг FBmyc H проявил наибольший процент выживших фаговых частиц после лиофилизации в среде под №3-36,5%. Содержимое препарата имело равномерное окрашивание и хорошо отставало от стенок ампулы, таблетка образовывалась.
Рисунок 2 - Высушенные бактериофаги FBс №96
Рисунок 3 - Высушенные бактериофаги FBmyc H
Наименьшую выживаемость фага наблюдали в среде №2- 0,6%. Внешний вид препарата в данной среде был самым плохим и не соответствовал ни одному критерию, кроме равномерной окраски. По результатам можно предположить, что на бактериофаг FBmyc H положительно влияют среды с содержанием витаминов.
Можно также сказать, что внешний вид препарата не всегда говорит о том, что его действие намного ниже препарата с лучшими внешними показателями.
Список литературы
1. Долинов К. Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К. Е. Долинов // Изд. «Медицина», М.-1969. -232 с.
2. Македонова Л.Д. Подбор защитных сред для лиофильного высушивания холерных фагов / Л.Д. Македонова, В.И. Арутюнов, T.Л. Кудрякова, Л.А.Наталич, В.В. Кадетов // Вирус микроорганизмов и растений: Тез.Всесоюз.конф., Ташкент, 1986.-C.203-204.
3. Белоус А.М. Криоконсерванты / А.М. Белоус, М.И. Шраго, Н.С. Пушкарь. - Киев: Наукова думка, 1979. -198 с.
4. Калдыркаев А.И. Изучение некоторых биологических свойств бактериофагов вида Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, Г.Ф. Архипова // Материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ - Покров, 2009.- 157-159 с.
5. Калдыркаев А.И. Изучение чувствительности бактерий рода Bacillus к различным концентрациям хлорида натрия / А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, С.В. Мерчина // Материалы Международной научнопрактической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения». - Ульяновск: УГСХА, 2011. - С.185-188.
6. Калдыркаев А.И. Анализ изменений литической активности фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis при хранении / А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, С.В. Мерчина //Материалы Международной научнопрактической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения». - Ульяновск: УГСХА, 2011. -С.188-191.
7. Калдыркаев А.И. Методика выделения фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина //«Естественные и технические науки». - М.: издво «Спутник+», 2011. - №2 (52). - С. 83-86.
8. Калдыркаев А.И. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus / А.И. Калдыркаев, В.А.Макеев, М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова //«Вестник Ветеринарии». - Ставрополь: изд-во «Энтропос». - 2011. - № 4. - С.88-89.
9. Васильев Д.А. Характеристика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.Н. Хайруллин, Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 1. - С. 79-83.
10. Калдыркаев А.И. Основные биологические свойства фагов бактерий Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин, Д.А. Васильев //Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве». - Саратов, - 2013. - С. 213-215.
11. Васильев Д.А. Биоиндикация бактерий Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, М.А. Лыдина, А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, И.Г. Швиденко // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С. 52-56.
12. Феоктистова Н.А. Распространение Bacillus cereus и Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2014. - № 1 (25). - С. 68-76.
13. Феоктистова Н.А. Особенности выделения бактериофагов Bacillus cereus / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев // «Актуальные проблемы биологии, биотехнологии, экологии и биобезопасности» Международная научно-практическая конференция посвященная 80-летию заслуженного ученого, профессора В.Л. Зайцева. - Ульяновск: УГСХА, - 2015. - С. 293-296.