Статья: Применение ксеногенного нативного нереконструированного костного коллагена для замещения костных дефектов на модели критического дефекта костей свода черепа крыс

Все животные были индивидуально маркированы перфорациями ушных раковин; кроме того, клетки маркировались карточками, содержащими информацию о заселяющих клетку особях и проводимых с ними манипуляциях. В пилотном эксперименте крыс взвешивали ежедневно в течение семи дней после операции. В основном эксперименте после оперативного вмешательства крыс также взвешивали ежедневно в течение первых шести дней. Далее крыс взвешивали еженедельно, начиная со дня начала эксперимента (маркировки животных). Массу тела определяли с точностью ± 1 г при помощи технических весов Pioneer PA2102 (Ohaus). Распределение крыс по экспериментальным группам проводили путем рандомизации с использованием стандартного алгоритма GraphPad (GraphPad Prism).

Экспериментальная модель

В работе была использована экспериментальная модель дефекта костей свода черепа, состоящая в хирургическом удалении участка теменных костей диаметром 8 мм [30]. Дефект такой величины является «критическим», и у взрослых крыс при спонтанном заживлении костная ткань не заполняет его полностью [30]. В пилотном эксперименте на десяти крысах была отработана методика выполнения хирургической операции по созданию критического дефекта костей свода черепа. У части животных дефект оставляли незаполненным, другим крысам дефект заполняли аутотрансплантатом костной ткани (удаленным участком свода черепа). За состоянием животных наблюдали в течение 7 дней после операции, обращая внимание на целостность швов и видимые признаки послеоперационных осложнений, после чего подвергали эвтаназии и исследовали место создания дефекта макроскопически. В основном эксперименте (по шесть крыс на группу) была проведена оценка репаративных свойств медицинского изделия Bongraf COLLAGEN в сравнении с препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® и двумя контрольными группами с незаполненным костным дефектом и с дефектом, заполненным удаленным участком свода черепа по аналогии с пилотным экспериментом (таблица 1).

медицинский хирургический костный коллаген

Таблица 1. Схема основного эксперимента

Животных наркотизировали сочетанным внутрибрюшинным введением 15-20 мг/кг тилетамина, 15-20 мг/кг золазепама и 3-6 мг/кг ксилазина. Для подготовки операционного поля над сводом черепа сбривали шерсть и обрабатывали кожу антисептиками на основе этанола и повидон-йода. Далее для доступа к костям свода черепа разрезали кожу по средней линии головы, после чего разрезали соединительную ткань черепа и надкостницу и отслаивали их от черепа при помощи шпателя (рисунок 1А). Затем при помощи трепана диаметром 8 мм и стоматологического привода при низкой скорости вращения (около 1000 оборотов в минуту) и постоянном смачивании физиологическим раствором (0,9% NaCl) делали насечку на теменных костях черепа практически на полную толщину кости (до прозрачности). При помощи элеватора выпиленный фрагмент кости удаляли, формируя тем самым дефект (рисунок 1Б). При удалении костного фрагмента сохраняли целостность твердой мозговой оболочки и сосудов. Сформированный дефект обильно промывали физиологическим раствором и удаляли мелкие фрагменты костной ткани по краям, придавая дефекту круглую форму. Дефект оставляли незаполненным (отрицательный контроль), заполняли удаленными костями свода черепа (реимплантация, положительный контроль), препаратом-компаратором (Geistlich Bio-Oss®) или тестируемым препаратом (Bongraf COLLAGEN) (рисунок 1В).

Рисунок 1. Ход операции по созданию критического костного дефекта костей свода черепа крыс. А) создание костного дефекта при помощи трепана диаметром 8 мм, стоматологического привода и элеватора; Б) созданный незаполненный костный дефект; В) замещение костного дефекта (в примере костный аутотрансплантат); Г) ушивание соединительной ткани после замещения костного дефекта

Надкостницу сшивали рассасывающейся нитью Monocryl (Ethicon) (рисунок 1Г).

Кожу сшивали рассасывающейся нитью Т-сорб (Политехмед). После операции крысам вводили 10 мл/кг физиологического раствора подкожно каждые 1-1,5 часа и согревали при помощи электрогрелки до пробуждения. В первые двое суток после операции животным внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг нефопама и 50 мг/кг ко-тримоксазола 2 раза в день.

Через один либо три месяца от создания дефекта по три особи из каждой группы подвергали эвтаназии путем ингаляции СО2 в затравочной камере, при помощи стоматологического бора извлекали кости свода черепа, включающие область дефекта и окружающую неповрежденную ткань, и фиксировали их в забуференном фосфатом 4% растворе формалина (pH 7,27,6) в течение 48 часов. Хранение эксплантированных образцов костной ткани осуществляли в 1% водном растворе формалина при 2-8°С.

Микротомографический и гистологический анализ эксплантированной костной ткани С целью определения трехмерной структуры и минеральной плотности кости фиксированные образцы исследовали методом микрокомпьютерной томографии (SkyScan 1172, Вгикег) при разрешении ~ 8 мкм в вокселе. Томографирование исследуемых образцов проводили одновременно с калибровочными образцами диаметром 8 мм и минеральной плотностью гидроксиапатита 0,25 и 0,75 г/см3. При проведении исследования образцы поддерживали в увлажненном состоянии. Анализ микрокомпьютерных томограмм проводили при помощи программного обеспечения Са1Ап (Вгикег), рассчитывая минеральную плотность новообразованной костной ткани, а также количественные характеристики ее трехмерной структуры (объем новообразованной костной ткани, толщину новообразованных костных элементов и распределение их диаметра). После исследования образцы возвращали в 1% водный раствор формалина и хранили при 2-8°С до проведения гистологического исследования для оценки структуры костной ткани и прилежащих мягких тканей.

Для подготовки к гистологическому исследованию образцы выдерживали в декальцинирующем электролитном растворе (Эрго-Продакшн) при комнатной температуре в течение четырех суток до размягчения, достаточного для микротомной резки. Затем образец подвергали дегидратации в семи сменах 99,7% изопропанола (БиоВитрум) по 5 часов в каждой, пропитывали парафиновой средой Histomix (БиоВитрум) в двух порциях по 2 часа в каждой и заливали в парафин. После застывания парафиновые блоки подготавливали для резки на микротоме, для чего блок размечали так, чтобы можно было взять параллельные ступенчатые срезы из следующих областей: два по касательным линиям, проведенным через точки на противоположных краях дефекта, один через центр, пересекая дефект по его диаметру, и еще два посередине между центральным и описанными краевыми срезами. Все срезы монтировали на предметные стекла и после депарафинизации и регидратации окрашивали гематоксилином и эозином (БиоВитрум) по стандартному протоколу и исследовали с помощью микроскопа Axio Scope.Al (Carl Zeiss). Фотосъемку срезов осуществляли при помощи камеры AxioCam MRc 5 (Carl Zeiss) с программным обеспечением AxioVision 3.0 (Carl Zeiss).

Статистический анализ

Статистический анализ экспериментальных данных проводили в программе GraphPad Prism 6 (GraphPad Software). Данные представляли в виде среднего и стандартного отклонения от среднего. Анализ временных рядов осуществляли посредством двухфакторного дисперсионного анализа (факторы «группа» и «время»). Межгрупповые различия оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа, попарные сравнения групп проводили с использованием критерия Тьюки. Различия считали статистически значимыми при вероятности отвергнуть верную нулевую гипотезу р < 0,05.

Результаты

Результаты тестирования экспериментальной модели (пилотный эксперимент) и общее состояние животных в основном эксперименте

Рисунок 2. Общее состояние лабораторных крыс после оперативного вмешательства по замещению критического дефекта костей свода черепа в пилотном эксперименте (А) и основном эксперимента в краткосрочном (Б) и долгосрочном периодах наблюдения (В)

О состоянии животных после операции судили по объективным (масса тела) и субъективным данным (внешний осмотр). В пилотном эксперименте масса тела крыс после оперативного вмешательства снижалась в течение первых двух суток, после чего оставалась стабильной на протяжении недельного наблюдения (рисунок 2А). Наряду с операционной травмой снижение массы тела крыс было обусловлено использованием в послеоперационный период антибиотиков. По данным внешнего осмотра, состояние животных восстанавливалось на четвертые-пятые сутки после операции.

При макроскопическом осмотре послеоперационного поля через 7 дней после создания дефекта было обнаружено, что разрез кожи в значительной степени или полностью заживлен; видимых признаков воспаления выявлено не было. У животных из группы положительного контроля реимплантированные аутотрансплантаты костей свода черепа устойчиво находились в дефекте без смещения за счет новообразованной соединительной ткани.

В основном эксперименте было отмечено отсутствие выраженной динамики массы тела животных в течение первой недели после оперативного вмешательства вне зависимости от экспериментальной группы (рисунок 2Б). В то же время в течение всего времени эксперимента (12 недель) масса тела животных постепенно увеличивалась, также независимо от экспериментальной группы (рисунок 2В).

медицинский хирургический костный коллаген

Рисунок 3. Сравнение показателей новообразованной костной ткани при отсутствии заполнения созданного дефекта (отрицательный контроль), а также при замещении критического дефекта костей свода черепа крыс удаленными участками теменных костей (положительный контроль), классически применяемым в хирургической практике для замещения костных дефектов препаратом Geistlich BioOss® (ксеногенным костным гранулированным минералом, получаемым из крупного рогатого скота путем многоступенчатой очистки костной ткани и стерилизуемым гизлучением) или медицинским изделием Bongraf COLLAGEN (ксеногенным бесклеточным костным коллагеном высокой степени очистки в виде мембраны, получаемым из бычьих бедренных костей по оригинальной технологии OnIonTechтм и стерилизуемым посредством сверхкритической флюидной экстракции) А) оценка заполненного новообразованной костной тканью объема дефекта методом микрокомпьютерной томографии; Б) оценка минеральной плотности новообразованной ткани методом микрокомпьютерной томографии; В) оценка доли костной (минерализованной) ткани от просвета созданного дефекта при окрашивании гематоксилином и эозином; Г) оценка толщины новообразованных костных элементов методом микрокомпьютерной томографии.

Влияние медицинского изделия Bongraf COLLAGEN на репарацию искусственно созданного костного дефекта.

Центральную роль в оценке репаративного процесса при искусственном создании критического дефекта свода костей черепа занимает анализ объема новообразованной костной ткани в просвете дефекта, оцениваемого методом микрокомпьютерной томографии. Как и ожидалось, у крыс группы отрицательного контроля (спонтанная репарация костной ткани) костная ткань в просвете дефекта практически отсутствовала, а наибольший объем костной ткани в просвете дефекта был у крыс группы положительного контроля, которым реимплантировали удаленные кости свода черепа (рисунок 3А).

У крыс, костный дефект которых замещали препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® (очищенной и измельченной гетерологичной костной тканью в виде гранул) или тестируемым медицинским изделием Bongraf COLLAGEN (очищенным гетерологичным костным коллагеном в виде мембраны), объем костной ткани в просвете дефекта через 12 недель после операции был значительно выше, чем у животных группы отрицательного контроля (рисунок 3А). При заполнении костного дефекта изделием Bongraf COLLAGEN стоит отметить выраженную динамику к увеличению заполненного объема к 12-й неделе в сравнении с 4-й неделей после оперативного вмешательства (рисунок 3А).

Минеральная плотность ткани в росвете костного дефекта, заполненного препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® или тестируемым медицинским изделием Bongraf COLLAGEN, на 12-й неделе после операции была значимо выше, чем у крыс группы отрицательного контроля (рисунок 3Б). Заполнение дефекта препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® приводило к более выраженной минерализации в сравнении с изделием Bongraf COLLAGEN, c динамикой к увеличению минерализации на 12-й неделе после оперативного вмешательства в сравнении с 4-й неделей (рисунок 3Б).

Для оценки выраженности остеогенеза при анализе окрашивания срезов гематоксилином и эозином также была рассчитана доля минерализованной ткани от площади дефекта. В частности, у крыс без заполнения дефекта минерализованная ткань в просвете дефекта практически отсутствовала, а у крыс с реимплантированными костями свода черепа заполняла почти весь дефект (рисунок 3В). У крыс, дефекты свода черепа которых заполняли препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® или тестируемым медицинским изделием Bongraf COLLAGEN, доля минерализованной ткани в просвете дефекта составляла от 40 до 55% и не различалась между медицинскими изделиями или на разных сроках заживления (рисунок 3В).