Применение ксеногенного нативного нереконструированного костного коллагена для замещения костных дефектов на модели критического дефекта костей свода черепа крыс
Веремеев А.В., Болгарин Р.Н., Нестеренко В.Г., Андреев-Андриевский А.А.
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, Россия, Общество с ограниченной ответственностью «Матрифлекс», г. Москва, Россия, ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва, Россия
Веремеев Алексей Владимирович, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Матрифлекс» (125252, Россия, г. Москва, ул. Авиаконструктора Микояна, д. 12, корп. А, п. 1, эт. 2, оф. 1).
Болгарин Роман Николаевич, директор по развитию ООО «Матрифлекс» (125252, Россия, г. Москва, ул. Авиаконструктора Микояна, д. 12, корп. А, п. 1, эт. 2, оф. 1).
Нестеренко Владимир Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунологии ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации. (123098, Россия, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).
Андреев-Андриевский Александр Александрович, кандидат биологических наук, руководитель центра доклинических исследований ООО «НИИ митоинженерии МГУ» ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова» (119330, Россия, г. Москва, ул. Ленинские горы,
Резюме
Цель исследования. Оценить эффективность замещения костных дефектов при использовании ксеногенного нативного нереконструированного костного коллагена (медицинское изделие Bongraf COLLAGEN) в сравнении с другими широко применяемыми решениями (ксеногенный нативный костный минерал Geistlich Bio-Oss® и костный аутотрансплантат).
Материалы и методы. В работе была использована классическая модель создания критического (8 мм) дефекта костей свода черепа крыс (48 самцов породы Wistar или Sprague-Dawley). Созданный во время оперативного вмешательства дефект замещали медицинским изделием Bongraf COLLAGEN, препаратом сравнения Geistlich Bio-Oss®, костным аутотрансплантатом (удаленным участком костей свода черепа) либо оставляли незаполненным (отрицательный контроль, n = 6 на каждую группу). Через 4 или 12 недель от создания дефекта производили вывод животных из эксперимента (n = 3 на временную точку) и исследовали замещение дефекта костной тканью при помощи микрокомпьютерной томографии (объем новообразованной костной ткани, минеральная плотность новообразованной ткани, толщина новообразованных костных элементов и распределение их диаметра) и окрашивания гематоксилином и эозином (доля минерализованной ткани от просвета дефекта).
Результаты. Наилучшие показатели замещения костной ткани в области дефекта (объем и минерализация костной ткани, а также толщина костных элементов) ожидаемо наблюдались при замещении дефекта костным аутотрансплантатом. У крыс, костный дефект которых замещали изделием Bongraf COLLAGEN или препаратом сравнения Geistlich Bio-Oss®, наблюдались сопоставимые показатели замещения костной ткани, промежуточные между использованием костного аутотрансплантата и отсутствием заполнения дефекта. При этом была отмечена выраженная тенденция к регенерации костной ткани с течением времени при замещении дефекта изделием Bongraf COLLAGEN.
Заключение. Ксеногенный нативный нереконструированный костный коллаген (Bongraf COLLAGEN) сравним по эффективности при замещении костных дефектов с ксеногенным нативным костным минералом (Geistlich Bio-Oss®).
Ключевые слова: ксеногенные имплантаты, костный коллаген, Bongraf COLLAGEN, Geistlich Bio-Oss, замещение костных дефектов, критический дефект костей свода черепа крыс.
APPLICATION OF XENOGENEIC NATIVE BONE COLLAGEN FOR BONE REPAIR IN CRITICAL-SIZED RAT CALVARIAL DEFECT MODEL
ALEXEY V. VEREMEEV, ROMAN N. BOLGARIN, VLADIMIR G. NESTERENKO, ALEXANDER A. ANDREEV-ANDRIEVSKIY
Moscow State University, Moscow, Russian Federation Matriflex LLC, Moscow, Russian Federation
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation
Dr. Alexey V. Veremeev, MD, PhD, Chief Executive Officer, Matriflex LLC (Aviakonstruktora Mikoyana Street, 12, A, 2nd Floor, Office 1, Moscow, Russian Federation, 125252).
Mr. Roman N. Bolgarin, development director, Matriflex LLC (Aviakonstruktora Mikoyana Street, 12, A, 2nd Floor, Office 1, Moscow, Russian Federation, 125252).
Prof. Vladimir G. Nesterenko, MD, DSc, Professor, Head of the Immunology Department, Gamaleya National Research Epidemiology and Microbiology Centre (Gamaleya Street, 18, Moscow, Russian Federation,
r. Alexander A. Andreev-Andrievskiy, PhD, Head of the Center for Preclinical Trials, Mitoengineering Research Institute LLC, Moscow State University (Leninskie Gory Street, 73A, Moscow, Russian Federation,
Abstract
Aim. To evaluate the efficacy of bone repair using xenogeneic native bone collagen (Bongraf COLLAGEN) as compared to other widely applied orthopaedic solutions (xenogeneic native bone mineral Geistlich Bio-Oss® and bone autograft).
Materials and Methods. We employed a conventional critical-sized (8 mm) rat calvarial defect model (48 Wistar or Sprague-Dawley rats). The artificial defect was repaired using Bongraf COLLAGEN, Geistlich Bio-Oss® utilised as a comparator, bone calvarial autograft, or remained unfilled (n = 6 per group). Rats were euthanised 4 or 12 weeks postimplantation (n = 3 per time point) with the subsequent examination (repair extent, volume, thickness and mineral density of the repaired tissue) by means of microcomputed tomography and hematoxylin and eosin staining. Results. Expectedly, highest volume, thickness and mineral density of the repaired tissue have been observed in defects filled with autografts. Bongraf COLLAGEN and Geistlich Bio-Oss® also demonstrated a comparable and significant repair capability, yet the former option demonstrated higher bone regeneration rate.
Conclusion. Xenogeneic native bone collagen (Bongraf COLLAGEN) is comparable with xenogeneic native bone mineral (Geistlich Bio-Oss®).
Keywords: xenogeneic implants, bone collagen, Bongraf COLLAGEN, Geistlich Bio-Oss, bone repair, critical-sized rat calvarial defect.
Введение
Несмотря на совершенствование классических методов диагностики и лечения, разработку и внедрение в клиническую практику новых медицинских технологий и повышение доступности высокотехнологичной медицинской помощи в травматологии и ортопедии, повышение эффективности и сокращение сроков реабилитации после хирургических вмешательств на опорно-двигательном аппарате по-прежнему являются одними из наиболее важных медицинских и социально-экономических задач [1]. Особую актуальность данная проблема имеет вследствие высокой распространенности травм и иных патологий опорно-двигательного аппарата у лиц трудоспособного возраста [2-5]. Кроме того, в определенных случаях риск инвалидизации у таких пациентов остается достаточно высоким даже при своевременной диагностике и верно выбранной тактике лечения [2-5].
Поэтому в последние годы активно изучается возможность использования и ускорения естественных регенеративных процессов в качестве альтернативы полному механическому замещению костных дефектов при помощи керамических и металлических имплантатов [6-8].
Согласно результатам доклинических и клинических испытаний, использование костных трансплантатов признано «золотым стандартом» при лечении тяжелых переломов, устранении обширных дефектов костной ткани после травм и оперативных вмешательств, а также при замещении утраченных костей [9-11]. Оптимальным подходом является использование аутотрансплантатов [9], однако такой подход характеризуется рядом серьезных осложнений, связанных с его высокой травматичностью (массивная кровопотеря, ранняя послеоперационная боль, хроническая боль в месте забора трансплантата, развитие хронической инфекции), а также с ограниченностью источников забора аутологичного костного материала [10, 11]. Возможной альтернативой костным аутотрансплантатам могли бы являться аллотрансплантаты, однако они имеют значительно меньший остеокондуктивный и остеоиндуктивный потенциал [10, 11]. Кроме того, их использование связано с высоким риском инфицирования и иммунного отторжения организмом реципиента вследствие развития реакции «хозяин против трансплантата» [10, 11].
Таким образом, в связи с недостаточным количеством аутотрансплантатов и недостаточной эффективностью аллотрансплантатов, современные подходы направлены на разработку различных костных заменителей, опционально включающих костные или эндотелиальные клетки-предшественники или факторы роста в целях стимуляции пролиферации и дифференцировки клеток и активации регенеративных процессов в костной ткани [12-15]. В настоящее время тканевая инженерия и регенеративная медицина рассматриваются как перспективные области знания, обеспечивающие разработку новых методов лечения и медицинских изделий для лечения врожденных и приобретенных костных дефектов [12-15]. Подобные инновационные продукты могут успешно применяться в клинической практике у пациентов с врожденными патологиями опорно-двигательного аппарата, а также при доброкачественных новообразованиях костной ткани и травмах костей [16].
Костный коллаген I типа представляет собой нативный биоматериал, вместе с гидроксиапатитом (Ca10(PO4)6(OH)2) в первую очередь ответственный за биофизические и механические свойства костной ткани [17, 18]. Процесс выделения костного коллагена I типа из ксеногенной костной ткани обладает высокой технологичностью [19, 20]; кроме того, за счет своей волокнисто-пористой структуры выделяемый костный коллаген I типа высокопроницаем для лекарственных средств, после имплантации успешно заселяется клетками и обладает удовлетворительными механическими свойствами и высокой биосовместимостью, что делает его подходящей системой доставки лекарственных средств для таргетной терапии [21]. Помимо этого, костный коллаген I типа также используется в составе композитных материалов и применяется в качестве вспомогательного материала для увеличения остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств каркасов (матриксов, скаффолдов) для замещения костных дефектов [22, 23].
Поскольку в процессе эволюции структура молекулы коллагена изменилась крайне незначительно, биофизические (в том числе механические) свойства данного белка практически не зависят от биологического вида, из которого он выделен [24]. Поэтому, вследствие нецелесообразности использования в травматологии и ортопедии аутологичного коллагена, а также этических и экономических сложностей в отношении применения аллогенного коллагена, на первый план выходит ксеногенный коллаген, доступный для выделения из мелких и крупных животных в промышленных масштабах [25].
Важным достоинством ксеногенного нативного нереконструированного костного коллагена является то, что при выделении физико-химическими методами глубокой очистки и децеллюляризации он сохраняет свою нативную волокнисто-пористую структуру и практически не теряет своих исходных биофизических (в том числе механических) свойств, приобретая при этом высокую чистоту, что повышает его безопасность для рабочего персонала и пациентов, а также позволяет проводить импрегнацию различных биологически активных компонентов [26, 27]. За счет того, что выделяемый при помощи такого подхода ксеногенный костный коллаген сохраняет свои изначальные структуру и свойства, он способен обеспечивать полный спектр остеокондуктивных и остеоиндуктивных сигналов, характерных для нативной костной структуры и необходимых для развития костной ткани [27].
В промышленном производстве для выделения костного коллагена в медицинских целях стандартно используется как бычий, так и свиной костный материал. Несмотря на отсутствие видоспецифичности биофизических свойств коллагена, использование бычьего коллагена сопряжено с риском губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, чрезвычайно опасного и летального заболевания, вызываемого прионами [25]. В связи с этим более безопасным представляется использование свиного коллагена, который к тому же обладает еще более низкой иммуногенностью, чем бычий [28]. В то же время религиозные убеждения в некоторых географических регионах ограничивают применение каких-либо продуктов, получаемых из крупного рогатого скота или свиней. Кроме того, в Российской Федерации и во многих других странах до сих пор не было зарегистрировано ни одного случая губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота. По этим причинам как бычий, так и свиной коллаген остаются актуальными для регенеративной медицины и по сегодняшний день.
На основании оригинальной технологии выделения и обогащения бычьего костного коллагена было разработано отечественное медицинское изделие Bongraf COLLAGEN, представляющее собой ксеногенный нативный нереконструированный костный коллаген для замещения костных дефектов, потенциально пригодный к использованию в травматологии, ортопедии и стоматологии. Целью данного исследования было оценить эффективность замещения костных дефектов при использовании изделия Bongraf COLLAGEN в сравнении с костным аутотрансплантатом и широко применяемым в хирургической практике ксеногенным нативным костным минералом (Geistlich Bio-Oss®, Geistlich Pharma).
Материалы и методы
Объекты исследования
Медицинское изделие Bongraf COLLAGEN представляет собой ксеногенный бесклеточный костный коллаген высокой степени очистки в виде мембраны с нативной нереконструированной волокнисто-пористой структурой, получаемый из бычьих бедренных костей по оригинальной технологии OnlonTech™ путем многоступенчатой очистки костной ткани (последовательных стадий механической очистки, дезинфекции, удаления контаминирующих белков, делипидизации, выделения и обогащения коллагена, ферментации) и стерилизуемый посредством сверхкритической флюидной экстракции [29]. В качестве объекта сравнения (препарата-компаратора) было использовано медицинское изделие Geistlich Bio-Oss® (Geistlich Pharma), представляющее собой нативный костный гранулированный (диаметр гранул от 0,25 до 1 мм) минерал, получаемый из крупного рогатого скота путем многоступенчатой очистки костной ткани и стерилизуемый Y-излучением.
Лабораторные животные
Все эксперименты на лабораторных животных были проведены на базе виварно-экспериментального комплекса ООО «НИИ митоинженерии МГУ». В исследование было включено 48 самцов крыс линии Wistar или Sprague-Dawley со зрелым костным скелетом (возрастом от 4,5 до 6 месяцев) на момент начала эксперимента, полученных из научно-производственного подразделения филиала Института биоорганической химии Российской академии наук питомника лабораторных животных «Пущино». Животные были клинически здоровы, но, по данным микробиологического мониторинга, являлись носителями Helicobacter spp. и Gardia muris. Другие патогены из списка FELASA 2014 у животных выявлены не были. Длительность адаптации после получения из питомника составляла не менее 7 суток.
В первом (пилотном) эксперименте крысы были размещены в индивидуально-вентилируемых клетках в блоке передержки животных, во втором (основном) эксперименте в клетках открытого типа в барьерной зоне виварно-экспериментального комплекса. До операции крыс содержали в клетках Т3 (Tecniplast) с площадью пола 780 см2 по две особи или в клетках Т4 (Tecniplast) с площадью пола 1500 см2 по четыре особи. После моделирования костного дефекта крыс содержали изолированно в клетках Т3. На протяжении всего исследования животные имели неограниченный доступ к корму («Чара для содержания», Ассортимент-Агро) и стерильной обратноосмотической воде. В качестве подстила использовали деревянную щепу Lignocel (JRS). Все материалы, поступающие к животным, стерилизовали автоклавированием.
Температура в комнате содержания животных составляла 20-26°С, относительная влажность 30-70%, световой день 12 часов (включение света в 09:00).