4. Получение моноклональных антител (МАТ)
Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:
• иммунизация животных; подготовка клеток к слиянию;
• слияние;
• отбор индуцирующих специфические антитела клонов;
• клонирование и реклонирование;
• массовая наработка гибридомных клеток;
• получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;
• выделение антител.
Способ 1. В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью.
Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител, как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии.
Для получения моноклональных антител изолируют В-лимфоциты из селезенки иммунизированной мыши и производят их слияние с опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы). Это необходимо, так как жизнеспособность антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре ограничена лишь несколькими неделями. При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными.
Рисунок 1. Получение моноклональных антител.
Слияние клеток является редким событием, частота которого повышается в присутствии полиэтиленгликоля [ПЭГ (PEG)]. Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде), содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин.
Поскольку дТМФ существенно необходим для синтеза ДНК, миеломные клетки не могут выживать в присутствии аминоптерина. С другой стороны, клетки селезенки могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза ДНК гипоксантин и тимидин, однако и они существуют в течение ограниченного времени.
Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину.
В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Такие клетки необходимо выделить и размножить клонированием.
После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются последующей селекции.
В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши .
Одним из главных достоинств моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве при неизменных от партии к партии характеристиках.
Благодаря этой особенности появилась возможность создания стандартных диагностических наборов реагентов для определения различных веществ.
Способ 2. Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела.
Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами.
Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.
Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов.
В то же время, для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда.
Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлем.
Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
Животное иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду они гибнут.
Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.
Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон).
Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.
Способ 3. Другой метод получения антител основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки.
Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость).
Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются.
Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют.
Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток.
Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.
5. Цитокины
Цитокины -- белки, воспроизводимые организмом при наличии патогенного воздействия -- вирусного инфицирования, бактериальных эндотоксинов, чужеродных клеток, митогенов, антигенов. Они не являются самостоятельным лекарственным средством, это -- клеточные гормоны, осуществляющие доставку иммунных клеток к патологическому очагу.
Терапию цитокинами при злокачественных патологиях не применяют так широко, как химиотерапию, облучение. Но методика показала высокую эффективность, достаточную безвредность для организма.
5.1 Интерферон в биотехнологии
Отличительной особенностью рекомбинантных интерферонов является то, что они получены вне организма человека (продуцируются бактерией E. coli, в ДНК которой встроен ген человеческого интерферона). Это значительно удешевляет производство, плюс сводит к нулю вероятность передачи какой-либо инфекции от донора.
5.2 Интерлейкин-2 человека рекомбинантный
метаболизм клетка иммуноглобулин интерферон
Рекомбинантный интерлейкин? 2, получен биотехнологическими методами из клеток-продуцента -- рекомбинантного штамма непатогенных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген интерлейкина? 2 человека. Представляет собой полипептид, состоящий из 133 аминокислот, является структурным и функциональным аналогом эндогенного человеческого интерлейкина? 2.
6. Получение сыворотки
Лечебные и профилактические гетерологичные сыворотки получают путем иммунизации ослов и лошадей, поскольку эти животные более реактогенные, чем другие, и дают большой выход антител. Кроме того, лошадиный белок анафилоктогенен.
Для получения антитоксических сывороток животных вначале иммунизируют анатоксином, а после создания базисного иммунитета - возрастающими дозами токсина. Антибактериальные сыворотки получают путем введения животным убитых или живых микробов. Из крови животных выделяют плазму, затем из нее удаляют фибрин получают сыворотку.
Забор крови у этих животных производят в период максимального содержания антител, однако для этого необходимо постоянно контролировать кровь по такому показателю, как титр антител.
Антитоксические сыворотки титруются в антитоксических или международных единицах (АЕ или МЕ). За 1 АЕ принимают минимальное количество сыворотки, предохраняющее определенный вид животных от гибели при заражении специально подобранной дозой токсина. Так, 1АЕ антидифтерийной сыворотки - это наименьшее количество сыворотки, которое на протяжении 4 суток предохраняет от смерти морскую свинку массой 250г, инфицированную 100 ДLМ дифтерийного токсина.
Антибактериальные и антивирусные сыворотки не тетрируются и вводятся по клиническим показаниям в миллилитрах. При определении их дозы учитывается тяжесть, день заболевания и возраст больного.
Полученные выше описанным способом сывороточные препараты характеризуются относительно низкой активностью и существенным количеством примесей.
Сыворотки можно получать также из культивируемых на искусственной питательной среде животных клеток. Однако главной проблемой в этом случае является обеспечение стабильного роста животных клеток вследствие их генетической нестабильности, непостоянства генетических экспрессий и старения.
Нередко для лечения и профилактики инфекционных болезней используются гомологичные сыворотки здоровых доноров, переболевших людей или препараты плацентарной крови.
В целях снижения токсичности, уменьшения аллергического действия и концентрации иммуноглобулинов сыворотки освобождают от балластных белков. При этом используют методы фракционирования с помощью спирто-водных смесей при температуре 0° С, ультрацентригугирования, электрофореза, ферментативного гидролиза. Очищенные и концентрированные препараты гамма-глобулиновой фракции сывороточных белков, содержащие высокие титры антител, называют иммуноглобулинами, а в практике - гамма-глобулинами. Современная технология изготовления человеческого гамма-глобулина гарантирует полную гибель вирусов гепатита.
Заключение
Таким образом, сегодня в руках врачей находится целый арсенал иммуномодуляторов, рассчитанных на множество конкретных случаев. В данной области Россия опережает многие развитые страны, где разработано и внедрено по 4 -5 препаратов, в России же - десятки.
Наличие большого числа иммуномодуляторов не должно пугать практических врачей. Иммунная система состоит из ряда тесно связанных в функциональном плане компонентов, задача которых заключается в элиминации из организма чужеродных веществ антигенной природы. У каждого из компонентов этой системы могут быть свои относительно специфические агенты.
Эра иммунокорригирующей терапии только началась, и после применения в клинической практике в конечном итоге будут отобраны наиболее эффективные препараты, которые, как аспирин, сердечные гликозиды, антибиотики и др., надолго войдут в число базисных препаратов в лечении тех или иных заболеваний. Как известно, практика - лучший критерий истины.
Используемая литература
1. Биотехнология: Принципы и применение / под редакцией И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса; пер. с англ.
2. Биотехнология: Учебное пособие для вузов / Под ред. Егорова.
3. Сазыкин Ю. О. Биотехнология: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева; под ред. А. В. Катлинского. - 3 е изд. , стер. - М. : Издательский центр «Академия» ,
4. Хаитов Р.М., Пинегин Б.?В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология.
5. Машковский М.Д. Препараты, коррегирующие процессы иммунитета (иммуномодуляторы, иммунокорректоры) В кн.: Машковский М.Д.Лекарственные средства: (пособие для врачей).
6. Покровский В.И. «Медицинская микробиология, иммунология, вирусология». Учебник для студентов фарм. ВУЗов, 2002.
7. https://findpatent.ru/patent/214/2149006.html Авторы патента: Внуков В.А. Гончарук А.В.