Автореферат: Полиморфизм гена рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа и факторы иммунного воспаления у больных ишемической болезнью сердца

Содержание общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) определялись в сыворотке крови ферментным методом реактивами «Vital» (Россия) на анализаторе Synchron CX4PRO (Beckman. США), единицы измерения ? ммоль/л. Уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) оценивали ферментным методом реактивами фирмы «Cormay» (Польша) на приборе «Cormay Livia» (Италия), единицы измерения - ммоль/л.

Молекулярно-генетическое обследование больных ИБС проводи-лось в несколько этапов: а) выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты из лейкоцитов венозной крови. б) проведение полимеразной цепной реакции. в) выявление полиморфных вариантов гена рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа методом рестрикционного анализа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась на автомати-ческом термоциклере «MJ Research» (MJ Research Inc. США) с использо-ванием термостабильной рекомбинантной Taq полимеразы. Проводили рестрикционный анализ с применением вертикального электрофореза. Использовали синтетические олигонуклеотиды OOO Beagle.

Уровень ИЛ-6 плазмы крови исследовали твердофазовым иммуноферментным методом с помощью набора реагентов ООО «Цитокин» (Россия). В качестве индикатора фермента применялась пероксидаза хрена. VCAM-1 и ИЛ-8 определяли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа на реактивах фирмы Bender Medsystems. Технология подготовки образцов плазмы крови и проведения иммуноферментного анализа была стандартной, но использовались реактивы и технологические модификации, предложенные фирмой-производителем.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов специализированных компьютерных программ SPSS 11.5 for Windows (SPSS Inc.) и Statistica 6.0 (StatSoft Inc.). Исходя из характера распределения количественных показателей использовали параметрические и непараметрические методы сравнения. Сравнение количественных показателей группах осуществлялось с использованием критериев Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, модуля ANOVA. Изучали корреляционные связи между полученными данными. Для анализа дихотомических переменных использовали критерий Фишера. Соотношение рисков оценивали по общепринятому показателю Odds-ratio (OR). Проводили также пошаговый логистический регрессионный анализ. Значимыми считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

L162V полиморфизм гена PPAR-alpha определён у 177 больных ИБС и 55 здоровых мужчин сопоставимого возраста. Встречаемость L162V генотипа гена PPAR-alpha у больных ИБС была выше, чем в группе здоровых людей, p=0,04 (Таблица1). Встречаемость V162 аллеля в группе больных ИБС была выше, чем в контрольной группе (0,06 и 0,02 соответственно, p=0,046). V162V генотип гена PPAR-alpha у больных ИБС и здоровых людей не выявлялся. В группе больных с L162L генотипом у 96 человек имела место стенокардия напряжения III функционального класса, у 51 -II функционального класса и у 9 -I функционального класса. Среди пациентов - носителей L162V генотипа у 7 был II функциональный класс стенокардии напряжения, у 14 - III функциональный класс. Достоверных различий в распределении L162L и L162V генотипов у больных ИБС с наличием или отсутствием артериальной гипертензии, абдоминального ожирения, фактора курения, отягощённой наследственности выявлено не было. Если в группе больных с ИБС сахарным диабетом 2 типа носителями L162V генотипа были 6 из 30 (20%) больных, то в группе больных ИБС без сахарного диабета носителями L162V генотипа были 15 из 147 человек (10,2%). Достоверных различий в показателях липидного спектра крови у больных ИБС ? носителей L162L и L162V генотипов гена PPAR-alpha выявлено не было. У больных ИБС с дебютом заболевания в возрасте до 55 лет встречаемость L162V генотипа была выше, чем в подгруппе пациентов с развитием заболевания в возрасте 55 лет и старше (Таблица1), OR=2,6 (1,02ч6,64)). Встречаемость V162 аллеля в группе пациентов с дебютом заболевания в возрасте до 55 лет была выше, чем у больных с более поздним дебютом заболевания (0,09 и 0,04 соответственно). Таким образом, носительство L162V генотипа гена PPAR-alpha было ассоциировано с риском дебюта ишемической болезни сердца в возрасте до 55 лет.

Таблица 1 ? Распределение L162L, L162V генотипов и встречаемость аллелей L162 и V162 аллелей гена рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных с дебютом ишемической болезни сердца в различном возрасте и у здоровых людей

В группе больных, у которых первый инфаркт миокарда развился в возрасте моложе 55 лет встречаемость L162V генотипа гена PPAR-alpha была выше, чем в подгруппе пациентов с дебютом первого инфаркта миокарда в возрасте 55 лет и старше: у 11 из 46 (23,9%) и 5 из 67 (7,5%) соответственно, p=0,01, OR=3,9 (1,25ч12,13). Встречаемость V162 аллеля в группе больных, перенесших инфаркт миокарда в возрасте до 55 лет была выше, чем у больных с более поздним развитием инфаркта миокарда (0,12 и 0,04 соответственно, p=0,014).

Проведено клинико-иммунологическое обследование 80 больных, выделенных методом случайной выборки из общей когорты пациентов, которым было выполнено генотипирование. Уровень VCAM-1 плазмы крови больных ИБС был выше, чем у здоровых людей: 991,6±42,3 нг/мл и

657,1±47,4 нг/мл соответственно, p<0,01. В группе пациентов с ИМТ>29,9кг/м2 уровень этой адгезивной молекулы составил 1080±66,5 нг/мл, что достоверно выше, чем у больных с ИМТ<=29,9кг/м2 (885±48 нг/мл, p<0,01). Установлена достоверная положительная корреляционная связь между уровнем VCAM-1 и содержанием ИЛ-6 плазмы крови: r=0,25, p<0,05. У больных ИБС ? носителей L162V генотипа гена PPAR-alpha отмечено повышение уровня VCAM-1 плазмы крови по сравнению с пациентами ? носителями L162L генотипа (1054±129 нг/мл и 965±48 нг/мл соответственно, p<0,05).

Если в группе больных ИБС без проявлений церебрального атеросклероза содержание VCAM-1 в плазме крови составляло 918±37 нг/мл, то у пациентов с верифицированными функционально значимыми клинико-инструментальными проявлениями атеросклероза церебральных артерий уровень VCAM-1 был выше: 1144±67 нг/мл, p<0,01.

Содержание ИЛ-6 в плазме крови у больных ИБС с L162L и L162V генотипами гена PPAR-alphа не имело достоверных различий. Уровень ИЛ-8 у больных ИБС с L162V генотипом был выше, чем у носителей L162L генотипа и здоровых людей - 2208±90,4 пкг/мл, 484,0±57,2 пкг/мл (p<0,001) и 572,1±128 пкг/мл (p<0,001) соответственно.

Оценивалась гиполипидемическая эффективность терапии розувастатином в дозе 10 мг в сутки у 30 больных ИБС (26 мужчин и 4 женщины в возрасте от 45 до 72 лет). Носителями L162L генотипа были 25 человек, L162V генотипа ? 5 пациентов. Длительность терапии составляла 3 месяца. Терапия розувастатином сопровождалась выраженным гиполипидемическим эффектом и снижением уровня ИЛ-6 (Таблица 2).

Таблица 2 ? Показатели липидного спектра сыворотки крови, молекулы сосудистой адгезии 1 типа и интерлейкина-6 у больных ишемической болезнью сердца до и после терапии розувастатином

На фоне терапии розувастатином у больных ИБС ? носителей L162L генотипа ОХС снизился с 5,88±0,34 ммоль/л до 4,34±0,19 ммоль/л, p<0,01; ХС ЛПНП ? с 3,83±0,13 ммоль/л до 2,20±0,33 ммоль/л, p<0,01; ТГ? с 1,88±0,26 ммоль/л до 1,49±0,27 ммоль/л, p<0,05. Терапия розувастатином у больных ИБС ? носителей L162V генотипа сопровождалась снижением ОХС с 5,75±0,59 ммоль/л до 4,02±0,38 ммоль/л, p<0,05; ХС ЛПНП с 3,17±0,12 ммоль/л до 2,18±0,43 ммоль/л; ТГ ? с 2,10±0,53 ммоль/л до 1,76±0,72 ммоль/л, р=0,057. Терапия розувастатином сопровождалась снижением содержания ИЛ-6 плазмы крови с 8,65±1,12 пкг/мл до 5,83±0,98 пкг/мл, p<0,05. Не было установлено побочных эффектов и непереносимости розувастатина, а также повышения уровня печёночных трансаминаз.

У больных ИБС с фракцией выброса менее 55% встречаемость L162V генотипа гена PPAR-alpha была выше, чем в подгруппе пациентов с фракцией выброса ?55%: у 15 из 60 (25,0%) и у 3 из 55 (5,5%) соответственно, p=0,0029, OR=5,8 (1,57ч21,2). Встречаемость V162 аллеля в группе больных с фракцией выброса менее 55% была выше, чем у больных с ИБС с фракцией выброса ?55% (0,125 и 0,027 соответственно, p=0,039). Установлена тесная отрицательная корреляционная связь между фракцией выброса левого желудочка и индексом массы миокарда: r=?0,568, p=0,000037. Кроме того, была установлена тесная отрицательная корреляционная связь между фракцией выброса и конечно- диастолическим размером левого желудочка (r=?0,487, p=0,0022) и

13

конечно-диастолическим размером левого предсердия (r=?0,490, p=0,0029). Выявлено увеличение индекса массы миокарда у больных с L162V генотипом: 149,9±4,69 г/м2 и 118,6±2,80 г/м2 у больных ИБС с L162L генотипом, p<0,001.

Установлена тесная корреляционная связь между индексом массы миокарда и конечно-диастолическим размером левого желудочка: r=0,674, p<0,001 и левого предсердия: r=0,536; p<0,001. Выявлена тесная положительная корреляционная связь между индексом массы миокарда и функциональным классом сердечной недостаточности у больных ИБС: r=0,636, p=0,000004.

Таким образом, в обследованной группе больных ИБС частота L162V генотипа была вдвое больше, чем в популяции по данным Фрамингемского исследованиия и в группе практически здоровых людей сопоставимого возраста. Впервые установлено, что у больных ИБС ? носителей L162V генотипа терапия розувастатином в плане гиперхолестеринемии была так же эффективна, как и у носителей L162L генотипа. D.M. Flavell и соавторов [2000], не выявили различий в ответе на гиполипидемическую терапию (использовалась терапия фибратами) у больных сахарным диабетом 2 типа ? носителей L162L и L162V генотипов гена PPAR-alpha.

В настоящей работе было установлено, что у больных ИБС с дебютом заболевания в возрасте до 55 лет встречаемость L162V генотипа и V162 аллеля гена тканевого фактора были достоверно выше, чем в подгруппе пациентов с развитием заболевания в возрасте 55 лет и старше. Установлено, что носительство L162V генотипа было ассоциировано с повышенным риском дебюта инфаркта миокарда в возрасте до 55 лет. Проведён множественный пошаговый логистический регрессионный анализ зависимости возраста дебюта ИБС от таких показателей, как индекс массы тела, генотип гена PPAR-alpha, индекс массы миокарда, наличие сахарного диабета, уровень триглицеридов, липопротеинов низкой плотности, липопротеинов высокой плотности. Была выявлена достоверная множественная регрессионная зависимость между вышеуказанными клиническими показателями у больных с различными полиморфными вариантами гена рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа: r=0,39, p<0,001.

Максимальный вклад в уравнение логистической регрессии вносили такие показатели, как повышение уровня триглицеридов плазмы крови (в=?0,299), повышение индекса массы тела (в=?0,146), генотип рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа (в=?0,076). Фактором "антириска" был уровень ХС ЛПВП. Менее значимые показатели: уровень ХС ЛПНП, наличие сахарного диабета, индекс массы миокарда не вносили существенный вклад в уравнение логистической регрессии.

Известны данные A. Skoczynska и соавторов [2005], которые установили, что частота V162 аллеля полиморфизма L162V в четыре раза чаще встречалась у больных с ангиографически верифицированным коронарным атеросклерозом в европейской популяции. Из обследованных в данной работе больных ? носителей V162 аллеля, у 7 пациентов, перенесших инфаркт миокарда в возрасте до 55 лет, имелись трёхартериальные стенозы коронарных артерий по данным коронароангиографии, а у одного пациента - двухартериальные стенозы. По-видимому, неблагоприятное течение ишемической болезни сердца у больных ? носителей V162 аллеля было связано с тяжёлыми стенозирующими поражениями коронарных артерий.

Известно, что повышенный уровень сосудистых адгезивных молекул и интерлейкина-6 ассоциируется с риском развития ИБС [Jenny N. et al., 2002; Luc G., 2003; Lowe G., 2004]. PPAR-alpha регулируют экспрессию генов ИЛ-6 и VCAM-1, а также ряда других маркеров воспаления [Broncel M., 2007]. Повышенная активность медиаторов воспаления ухудшает прогноз ИБС [Палеев Ф.Н. и соавт., 2009]. В настоящем исследовании показано, что у больных ? носителей L162V генотипа гена PPAR-alpha высокая активность маркеров иммунного воспаления (VCAM-1, ИЛ-8) сочеталась с развитием ИБС и инфаркта микарда в возрасте до 55 лет.

Рецепторы активатора пролиферации пероксисом-альфа экспрессируются в гладкомышечных клетках аорты и коронарных артерий. Опосредованная PPAR-alpha репрессия факторов иммунного воспаления осуществляется через сигнальный путь ядерного фактора каппа-бета (NF-kB). Снижается продукция ФНО-альфа, который, является основным медиатором экспрессии VCAM-1 эндотелиоцитами [Marx N et al., 1999]. Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между уровнем VCAM-1 в плазме крови и содержанием ИЛ-6 у больных ИБС. Эта особенность также укладывается в факт активации иммунного воспаления. У больных ИБС ? носителей L162V генотипа уровни VCAM-1 и интерлейкина-8 были выше, чем у пациентов с L162L генотипом. По-видимому, носительство L162V генотипа уменьшает аффинность PPAR-alpha к естественным лигандам и, соответственно, их физиологическую активность, направленную на подавление продукции провоспалительных цитокинов (рисунок 1).

Рисунок 1 ? L162V полиморфизм гена рецепторов активатора пролиферации пероксисом-альфа и продукция провоспалительных цитокинов у больных ишемической болезнью сердца

В экспериментальном исследовании I. Rudkowska и соавторов [2009] было установлено, что L162V генотип гена PPAR-alpha ассоциируется с более низкой транскрипционной активностью, и, соответственно, с менее эффективной регуляцией иммунного воспаления.