Удмуртский государственный университет
Особенности формирования металлрезистентности при инокуляции томата микромицетом Cylindrocarpon magnusianum
Бухарина И.Л., Исламова Н.А., Жавад А.Ф.,
Абдуллах М.Р., Лебедева М.А., Шашов Л.О.
Аннотация
В статье приведены результаты экспериментов по исследованию влияния инокуляции эндотрофным микромицетом Cylindrocarpon magnusianum на физиолого-биохимические показатели тестовых растений томата. Схема эксперимента включала инокуляцию культурой гриба (контрольная популяция) и популяциями этого гриба, предварительно выращенными на агаризированных средах с внесением разных концентраций тяжелых металлов. Инокулированные растения выращивались на контрольном субстрате (без внесения тяжелых металлов) и на субстратах с внесением разных концентраций тяжелых металлов (цинка, меди, свинца и хрома). Инокуляция растений томата контрольной популяции гриба при действии солей тяжелых металлов в субстрате привела к снижению содержания хлорофилла а, при действии солей хрома ? к снижению содержания хлорофилла b и каротиноидов в листьях, а также к снижению биомассы растений. Стимулирующего эффекта, повышающего устойчивость растений к действию солей тяжелых металлов, при инокуляции растений контрольной популяцией гриба Cylindrocarpon magnusianum не выявлено. В то же время при инокуляции растений популяциями гриба, адаптированными к действию солей тяжелых металлов, и при последующем выращивании растений на контрольном субстрате в большинстве вариантов выявлен эффект увеличения содержания хлорофиллов а и b.
Минимальные различия с контролем по физиологическим и морфологическим показателям растений наблюдались лишь при инокуляции растений популяциями Cylindrocarpon magnusianum, адаптированными к разным концентрациям солей тяжелых металлов, и при выращивании инокулированных растений в условиях высокого содержания солей тяжелых металлов в субстрате.
Ключевые слова: CYLINDROCARPON MAGNUSIANUM, МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ, ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ, ИНОКУЛЯЦИЯ, ХЛОРОФИЛЛЫ, КАРОТИНОИДЫ, БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Основная часть
В настоящее время в научном сообществе повысился интерес к изучению роли консортивных связей растений с микромицетами. Определенные успехи достигнуты в изучении роли эндомикоризы и ее самой распространенной формы ? арбускулярной микоризы (АМ), которая характерна для большинства современных филогенетических групп растений и представлена во всех биомах земного шара. Она формируется облигатно-биотрофными грибами, принадлежащими подотделу Glomeromycotina отдела Mucoromycota [1, 2].
Но использование АМГ в растениеводстве ограничено, что является следствием их облигатной симбиотрофии. Все существующие на данный момент способы получения инокулюма АМГ основаны на использовании системы «растение-гриб», т.е. бинарной культуры [3, 4]. Существует и определенная проблема идентификации АМГ до уровня вида с использованием молекулярных маркеров, хотя были приложены значительные усилия в этом направлении [1, 5-7].
В связи с этим особый интерес вызывает изучение роли группы грибов эндофитов и их отдельных представителей в формировании механизмов устойчивости у высших растений. Все растения в естественных экосистемах оказываются связанными с симбиотическими грибными эндофитами. Исторически, были выделены две группы эндофитов (Сlavicipitaceous (C) и Nonclavicipitaceous (NC)) на основе филогении и признаков жизненного цикла [8]. Эта разнородная группа грибов может оказывать сильное воздействие на растительные сообщества посредством обеспечения устойчивости растений к абиотическому и биотическому стрессу, увеличения биомассы и снижения потребления воды или путем изменения распределения минеральных ресурсов. Пристальное внимание к группе грибов-эндофитов связано с поиском природных биорегуляторов и биоконтроллеров устойчивости растений, в том числе к внешним и внутренним патогенам (например, вирусным инфекциям) [8, 9].
Ряд научных работ последних лет сосредоточен на изучении совместного влияния АМГ и ассоциированных с ними эндофитами на физиологию и формирование механизмов устойчивости растений в экстремальных условиях среды [8, 10-13].
В этой связи одним из перспективных является эндофит Cylindrocarpon magnusianum [14-16]. Установлено, что метаболиты Cylindrocarpon magnusianum, полученные в жидкой среде, могут быть использованы в борьбе с нематодами [15]. Этот гриб способен расти в условиях высокого содержания нефтепродуктов в почве, что может быть востребовано в восстановении нефтезагрязненных земель [14-15]. В серии авторских экспериментов, проведенных с Cylindrocarpon magnusianum, установлено, что культуры этого гриба способны выдерживать действие высокого осмотического давления, сохраняя рост культурального мицелия. А опыты с инокулированными данным грибом растениями показали возможность использования данного микромицета в качестве агента повышения солеустойчивости растений [16]. микромицет инокуляция томат гриб
Отсюда целью нашего исследования являлось изучение влияния инокуляции томата культурой Cylindrocarpon magnusianum на устойчивость растений к действию солей тяжелых металлов в субстрате.
Культура Cylindrocarpon magnusianum выделена из корневой системы древесных растений (хорошего жизненного состояния), произрастающих в условиях городских почв с высоким содержанием солей тяжелых металлов. Изоляты культивируются на питательных средах.
Видовая принадлежность гриба установлена методами молекулярного анализа ДНК в лаборатории Лейбницкого института овощных и декоративных культур (г. Берлин) [17]. Проведена экстракция ДНК, PCR-анализ, секвенирование продуктов амплификации (метод секвенирования по Сэнгеру). Для сравнения полученных результатов с известными последовательностями была использована база данных генных последовательностей NСBI databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Согласно схеме эксперимента, подготовлены изоляты (популяции) гриба на субстратах с внесением разных концентраций солей тяжелых металлов (А0 ? контрольный; А1 ? на субстрате с Zn100 мг/л, далее А2 ? Cu50, А3 ? Cu100, А4 ? Cu150, А5 ? Pb50, А6 ? Pb100, А7 ? Cr2,5, А8 ? Cr10 мг/л). Затем подготовлены суспензионные культуры этих популяций и проведена инокуляция растений томата. Опыт включал варианты: 1) инокулированные томаты (инокуляция контрольным изолятом А0) выращивались на субстратах с разным содержанием солей тяжелых металлов (В0 ? контрольный - без ТМ; В1 ? на субстрате с Zn100 мг/л, далее В2 ? Cu50, В3 ? Cu100, В4 ? Cu150, В5 ? Pb50, В6 ? Pb100, В7 ? Cr2,5, В8 ? Cr10 мг/л); 2) томаты, инокулированные популяциями грибов, адаптированными к тяжелым металлам, выращивались на субстратах без внесения и с внесением солей ТМ. Повторность вариантов опыта четырехкратная. Субстрат представлял собой смесь торфа низкой зольности и песка 1:2. Растения выращивались в климатической камере BinderKBWF720 при соблюдении оптимальных условий культуры томата (влажность субстрата 75%, освещенность 20000 лк (16 ч в сутки), температура воздуха: днем ? 23°С, ночью ? 19°С).
Оценка развития грибов-эндофитов в корнях проведена методом световой микроскопии.
Оценка устойчивости растений проведена на основе: анализа морфометрических показателей растений; содержания в листьях аскорбиновой кислоты (по ГОСТ 24556-89) и нитратов (по ГОСТ 29270-95); сухого вещества в надземной части и корневой системе растений (по ГОСТ 28561-90); фотосинтетических пигментов (хлорофиллы а и b, каротиноиды, спектрофотометрическим методом в ацетоновых экстрактах (поглощение 662, 644 и 440,5 нм, соответственно), расчет концентрации пигментов проведен по уравнениям Холма-Веттштейна).
Математическую обработку материалов осуществляли с применением статистического пакета программы “Statistica 6,0” методами описательной статистики.
Анализ результатов включал: 1) оценку влияния контрольной популяции гриба (А0) на физиологические показатели инокулированных растений (выращивание на субстратах с различным содержанием тяжелых металлов (ТМ) (В1?В8); 2) оценку влияния популяций гриба Cylindrocarpon magnusianum (выращенных на субстратах с разным содержанием тяжелых металлов А1?А8) на физиологические показатели инокулированных растений - выращивание растений на контрольном субстрате (В0); 3) оценку совместного влияния популяции гриба (А1?А8) и содержания ТМ в субстратах (В1?В8) на физиологические показатели растений (рис. 1?3, табл. 1).
Что касается инокуляции растений контрольной популяцией гриба, то при выращивании растений на субстратах с внесением Cu100, Pb10 и Pb50, Cr2,5 мг/л наблюдалось существенное снижение содержания хлорофилла а в листьях. На содержание хлорофилла b и каротиноидов достоверно повлияли (снижение) концентрации Cu100, Pb10, Cr2,5 2,5 мг/л.
При выращивании томатов, инокулированных разными популяциями гриба (адаптированы к субстратам с разным содержанием ТМ), на контрольном (без внесения ТМ) субстрате мы наблюдали достоверное увеличение содержания хлорофилла а в листьях по сравнению с контролем (за исключением популяций гриба Cr10 и Cu50, где, наоборот, установлены достоверно меньшие значения показателя).
Рис. 1 Содержание хлорофилла а в листьях инокулированных растений томата в условиях разных концентраций тяжелых металлов в субстрате
Рис. 2 Содержание хлорофилла b в листьях инокулированных растений томата в условиях разных концентраций тяжелых металлов в субстрате
Рис. 3 Содержание каротиноидов в листьях инокулированных растений томата в условиях разных концентраций тяжелых металлов в субстрате
Таблица 1
Морфологические и биохимические показатели инокулированных растений томата в условиях разных концентраций тяжелых металлов в субстрате
|
Варианты опыта: популяция (А)/ субстрат (В) |
Показатели |
||||||
|
биомасса, г |
содержание сухого вещества, % |
биохимические показатели |
|||||
|
надземная часть |
корни |
наземная часть |
корни |
нитраты, мг/100г |
витамин С, мг/100г |
||
|
Контроль/ Zn100 |
29,37±2,23* |
4,70±0,28 |
12,83±0,67 |
7,85±0,33v |
3890,43±159,98 |
37,84±4,45v |
|
|
Контроль / Cu50 |
25,54±0,80v** |
3,81±0,24 |
13,01±1,99 |
5,32±1,96v |
4327,69±144,58^ |
23,58±1,54v |
|
|
Контроль/ Cu100 |
24,31±1,86 |
4,40±0,30 |
12,64±0,02 |
13,79±3,80^ |
5326,66±110,37^ |
64,62±3,57 |
|
|
Контроль/ Cu150 |
27.60±0,70 |
3,63±0,24 |
12,14±0,89 |
13,29±1,13^ |
4308,72±298,07 |
48,83±1,12v |
|
|
Контроль/ Pb10 |
24,51±1,28 |
3,88±0,35 |
8,85±0,50v |
10,58±2,01 |
4321,20±258,40 |
42,43±0,55v |
|
|
Контроль/ Pb50 |
28,81±0,39 |
3,81±0,07 |
10,02±0,86v |
8,75±1,38 |
5014,62±466,07 |
60,59±0,59 |
|
|
Контроль/ Cr2,5 |
26,87±0,35 |
3,30±0,14v |
11,74±1,87 |
8,89±1,79 |
4415,13±331,23 |
46,72±3,02v |
|
|
Контроль/ Cr10 |
25,58±0,45v |
4,72±0,28 |
11,59±0,98 |
7,75±0,18v |
3213,16±96,82v |
59,32±3,08 |
|
|
Zn100/ Контроль |
25,58±0,73v |
3,84±0,12 |
14,92±2,32 |
9,35±1,41 |
3476,33±325,75 |
53,06±2,67v |
|
|
Zn100/ Zn100 |
27,80±0,64 |
4,72±0,45 |
14,95±1,23 |
11,19±2,20 |
3585,72±606,07 |
34,18±2,46 |
|
|
Cu50/ Контроль |
23,96±1,63 |
2,16±0,18v |
10,99±1,14 |
14,78±2,82 |
3365,41±72,51 |
55,48±3,54 |
|
|
Cu50/ Cu50 |
29,68±1,05 |
2,13±0,23 |
14,10±1,64 |
15,22±2,97 |
4638,21±346,77^ |
45,06±1,53 |
|
|
Cu100/ Контроль |
19,82±0,40v |
2,30±0,15v |
10,91±1,64 |
13,17±2,43 |
4837,86±206,82 |
49,83±3,69 |
|
|
Cu100 /Cu100 |
35,29±0,25^ |
2,39±0,69 |
12,67±0,82 |
12,68±2,45 |
3534,60±99,78 |
52,70±5,29 |
|
|
Cu150 / Контроль |
27,99±0,81 |
1,93±0,04v |
9,44±1,79 |
16,10±3,80 |
3058,14±25,50v |
39,20±4,92v |
|
|
Cu150/ Cu150 |
24,16±1,12 |
2,23±0,18 |
12,26±1,21 |
13,25±2,73 |
4487,60±103,26^ |
32,57±4,80 |
|
|
Pb10/ Контроль |
32,66±2,01 |
2,98±0,15v |
13,67±1,92 |
10,24±0,65 |
3356,96±241,51 |
46,72±2,28v |
|
|
Pb10/ Pb10 |
26,30±0,87 |
2,36±0,22 |
11,41±1,09 |
11,71±1,01 |
4488,58±102,55^ |
51,93±1,64 |
|
|
Pb50/ Контроль |
21,88±1,31v |
1,55±0,10v |
12,39±1,36 |
10,98±1,16 |
3986,02±82,59 |
62,36±2,98 |
|
|
Pb50 /Pb50 |
28,16±1,30 |
2,49±0,36 |
12,92±1,16 |
10,01±1,17 |
4229,96±177,36 |
48,05±0,90v |
|
|
Cr2,5/ Контроль |
21,59±2,04v |
1,92±0,08v |
12,24±0,26 |
11,38±1,85 |
4384,27±195,22 |
47,81±3,02v |
|
|
Cr2,5 /Cr2,5 |
29,54±0,09^ |
2,50±0,01^ |
13,16±0,61 |
9,52±1,49 |
4161,79±494,02 |
71,09±0,80 ^ |
|
|
Cr10/ Контроль |
16,36±0,94v |
1,56±0,15v |
13,12±1,98 |
14,17±2,00 |
5188,76±622,04 |
50,53±1,66v |
|
|
Cr10/Cr10 |
27,30±0,26^ |
2,06±0,22 |
14,23±2,73 |
11,90±1,12 |
3583,89±471,03 |
64,82±7,75 |
|
|
Контроль/ Контроль |
29,30±0,70 |
5,44±0,63 |
15,33±2,02 |
9,46±0,15 |
3693,55±87,76 |
63,48±2,50 |
Примечания: * ? указано среднее значение показателя ± стандартное отклонение; ** - показано достоверное отличие от контроля: увеличение ^ или уменьшение v показателя (р ?0,05).
А ? адаптированные популяции гриба, выращенные на агаровых субстратах с внесением разных концентраций солей тяжелых металлов (мг/л).
В ? субстраты с разным содержанием солей тяжелых металлов (мг/л).
Адаптированные популяции гриба Cylindrocarpon magnusianum, выращенные на субстрате с высоким содержанием хрома (Cr10), вызвали существенное снижение содержания хлорофилла b в листьях, тогда как популяции Zn100; Cu150; Pb10; Cr2,5 вызвали рост содержания этого пигмента. На содержание каротиноидов в листьях томата существенно повлияли популяции Cr2,5 и Cr10.
Таким образом, содержание хлорофиллов а и b в листьях оказалось более чувствительным показателем к действию инокуляции растений популяциями грибов при действии солей тяжелых металлов. При анализе влияния взаимодействия популяции гриба и содержания химических элементов в субстрате установлено, что на содержание фотосинтетических пигментов в листьях достоверное влияние оказали популяции гриба Pb10 и Cr2,5 (при выращивании растений на субстратах с аналогичным содержанием свинца и хрома), приводя к существенному снижению содержания хлорофиллов а и b в листьях, по сравнению с результатами выращивания растений (инокуляция популяциями гриба) на контрольном субстрате (В0). Достоверное снижение концентрации хлорофиллов а и b по сравнению с контрольным вариантом (А0В0) отмечено лишь в варианте популяции гриба Zn100 c последующим выращиванием растений в субстрате с содержанием цинка 100 мг/л, а достоверный рост показателей - в варианте с популяцией Cu100. Содержание каротиноидов существенно ниже контрольного варианта было лишь при использовании популяций Cr10, Zn100 и субстратов с содержанием хрома и цинка, соответственно, 10 и 100 мг/л.
При анализе влияния инокуляции томатов контрольной популяцией гриба на морфологические показатели выявлено, что при внесении в субстрат меди (50 мг/л) и хрома (10 мг/л) наблюдалось достоверное снижение биомассы надземной части растений. Содержание в субстрате хрома (2,5 мг/л) вызвало снижение биомассы корней.
При выращивании растений томата, инокулированных разными популяциями гриба Cylindrocarpon magnusianum, на контрольном субстрате (без ТМ) практически во всех вариантах опыта (за исключением популяций гриба Zn100) наблюдалось достоверное снижение биомассы корней. Популяции гриба Zn100, Cu100, Pb50, Cr2,5 и Cr10 также вызвали существенное снижение биомассы надземной части растений.