Материал: Основы_микроскопии

Микроскопическая техника

греч.mikros- малый иskopeo- смотрю

Микроскоп- оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений мелких объектов и их деталей, не видимых невооруженным глазом; представляет собой центрированную оптическую систему.

Сущность микроскопического метода исследования заключается в изучении микроорганизмов с помощью микроскопов различных типов и методов микроскопии (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, аноптральная, поляризационная, электронная и др.).

1. Цели микроскопии

Объектами микроскопии в медицинской практике обычно являются бактериальные клетки, вирусы, клетки человека и т.д.

Применение микроскопической техники позволяет оценить размер объектов, изучить их форму и расположение, а также получить информацию о строении (наличие отдельных структурных элементов).

Человек с нормальным зрением на оптимальном расстоянии (20-30 см) может увидеть в виде точки предмет размером 0,07-0,08 мм. Попытки преодолеть поставленный природой барьер были давно. Так, при археологических раскопках в древнем Вавилоне находили двояковыпуклые линзы - самые простые оптические приборы. Обычную лупу, увеличивающую изображение объекта в 10-20 раз, можно считать простейшим микроскопом.

Антони ван Левенгук (1632 - 1723)Конструктор первых микроскопов, основоположник научной микроскопии, исследовавший с помощью своих микроскопов структуру различных форм живойматерии.

2. Основыоптики

Свет- электромагнитная волна с характерной амплитудой и четко определенной длиной. Амплитуда волны придает свету яркость, а длина волны определяет его цвет.

Основные характеристики световой волны.

Диапазон электромагнитных волн и соответствующий вид микроскопии

Линза- это оптический прибор, преломляющий параллельные лучи в одной точке. Если лучи идут параллельно оптической оси линзы, то они пересекаются в точке, которая называется фокусом линзы. Фокуслинзы

находится на фокусном расстоянии от центра линзы.

Оптический центр линзы- точка, которая у двояковыпуклых или двояковогнутых (с одинаковыми радиусами поверхностей) линз находится на оптической оси внутри линзы (в её центре); это точка, проходя через которую лучи не меняют своего направления.

F - главный фокус

d - расстояние от предмета до линзы

f - расстояние от изображения предмета до линзы О - оптический центр линзы

NN - оптическая ось

Аберрация оптической системы– искажение или погрешность изображения в оптической системе, вызываемая отклонением луча от того направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе.

Главная оптическая ось линзы- прямая, проходящая через центры сферических поверхностей, ограничивающих линзу.

В микроскопиифокусное расстояниепонимается как расстояние между объективом и верхней частью наблюдаемого объекта. Фокусное расстояние оптической системы показывает, насколько сильно она собирает (фокусирует) свет. Чем больше увеличение объектива микроскопа, тем обычно меньше его фокусное расстояние.

Числовая апертура– это безразмерная величина, которая характеризует диапазон углов, в которых оптическая система может принимать или испускать свет. В микроскопии от числовой апертуры напрямую зависит и разрешение.

Основные оптические элементы микроскопа

1. Коллектор. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагмамикроскопа.

2. Конденсорсостоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от источника света наобъект.

Ирисовая диафрагмарасположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света.

3. Объектив- важнейший элемент оптической системы микроскопа, линза или система линз, собирающая и фокусирующая световые лучи от наблюдаемого объекта для получения изображения. Он определяет полезное увеличение объекта. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра.

4. Окуляр- действует как лупа и образует мнимое изображение на сетчатке глаза на расстоянии наилучшеговидения.

Парфокальность– расстояние от посадочной резьбы объектива до

микроскопируемого объекта. Это изменение рабочего расстояния, обратно пропорциональное изменению увеличения объектива, благодаря чему нам не нужно перефокусироваться после смены объектива, ведь чем больше увеличение объектива, тем он длиннее и тем меньше рабочее расстояние.

Подсчёт увеличения микроскопа:

Разрешение, илиразрешающую способность микроскопаможно определить как самое близкое расстояние между двумя отдельными точками образца, позволяющее визуально их различить.

Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 0,1 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.

Разрешающий лимит светового микроскопа с масляной иммерсией составляет ½ длины волны используемого света. Диапазон видимой части спектра от 400 нм до 750 нм. Теоретический предел разрешающей способности светового иммерсионного микроскопа составляет 0,2 мкм (200 нм).

Чтобы стать видимым, интенсивность излучения от объекта должна быть выше интенсивности излучения фона на какое-то минимальное, пороговое значение. Поэтому вводится понятиеконтраста. При ярком освещении порог контрастности равен 2-3%, в темноте - до 200-300%.

Полезное увеличение– это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Преломление луча света- это изменение направления распространения луча света при его переходе через границу раздела двух сред.

3. Световая микроскопия, иммерсионнаямикроскопия

В 1846 г. немецкий механик Карл Цейсе (1816-1888) открыл мастерскую и через год приступил к изготовлению микроскопов. Карл Цейсе успешно использовал в деятельности своей фирмы открытия профессора физики Эрнста Аббе, который впоследствии становится его полноправным компаньоном.

В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. Коптической системеотносят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).

Механическая системамикроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.

Основные элементы светового микроскопа.

Принципиальная схема получения изображения на световом микроскопе. Окуляр увеличивает изображение, построенное объективом и формирует мнимое изображение.

По принципу расчетного качества изображения объективы могут быть ахроматическими, апохроматическими, объективами плоского поля (план).

Ахроматические объективы.Рассчитаны для применения в спектральном диапазоне 486-656 нм. Исправление любой аберрации (ахроматизация) выполнено для двух длин волн. В этих объективах устранены сферическая аберрация, хроматическая аберрация положения, кома, астигматизм и частично - сферохроматическая аберрация. Изображение объекта имеет несколько синевато-красноватыйоттенок.

Апохроматические объективы.Имеют расширенную спектральную область, и ахроматизация выполняется для трех длин волн. При этом, кроме хроматизма положения, сферической аберрации, комы и астигматизма, достаточно хорошо исправляются также вторичный спектр и сферохроматическая аберрация, благодаря введению в схему линз из кристаллов и специальных стекол. По сравнению с ахроматами, эти объективы обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают четкое изображение и точно передают цветобъекта.

Современные объективы, обладающие промежуточным качеством изображения - полуапохроматы, носят название микрофлюары.

Планобъективы.В планобъективах исправлена кривизна изображения по полю, что обеспечивает резкое изображение объекта по всему полю наблюдения. Планобъективы обычно применяются при фотографировании, причем наиболее эффективно применение планапохроматов.

Иммерсионные объективы.Качество изображения, параметры и оптическая конструкция иммерсионных объективов рассчитываются и выбираются с учетом толщины слоя иммерсии, которая рассматривается как дополнительная

линза с соответствующим показателем преломления.Иммерсионнаяжидкость,расположенная между объектом и фронтальнымкомпонентомобъектива,увеличивает угол, под которым рассматривается объект(апертурныйугол).Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива непревышает1,0(разрешающаяспособностьпорядка0,3мкмдляосновнойдлиныволны);иммерсионного - доходит до 1,40 в зависимости отпоказателяпреломленияиммерсии и технологических возможностей изготовленияфронтальнойлинзы(разрешающая способность такого объектива порядка 0,12 мкм).Иммерсионные объективы больших увеличений имеюткороткоефокусноерасстояние - 1,5-2,5 мм при свободном рабочем расстоянии0,1-0,3мм(расстояние от плоскости препарата до оправы фронтальнойлинзыобъектива).Длятогочтобыувеличитьапертуруобъектива,пространствомеждурассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемойиммерсионной жидкостью(лат. погружение) – прозрачнымвеществомспоказателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкостииспользуютводу(n=1,33),кедровоемасло(n=1,52),растворглицеринаидругиевещества.Апертурыиммерсионныхобъективовбольшогоувеличениядостигают величины 1,5, тогда предельно достижимая разрешающая

способность иммерсионного оптического микроскопа составит 0,15 мкм.

1. Объектив.

2. Иммерсионнаясреда.

3. Препарат.

4. Покровноестекло.

5. Предметныйстолик.

4. Темнопольнаямикроскопия

Метод тёмного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных не абсорбирующих объектов, которые не могут быть

видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором темного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса, и прошедших через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающейсредой.

Если осветить объект косопадающим светом, то наблюдается явление Тиндаля: мелкие частицы, невидимые глазом, становятся видимыми, так как они сами начинают светиться отраженным светом. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом, вследствие чего неосвещенное поле остается темным, а микробные тела освещены очень ярко. При темнопольной микроскопии микробы изучают в препарате “раздавленная капля”, используя предметные стекла не толще 1,2 мм, а толщина покровных не должна превышать 0,2мм.

Для наблюдения в темном поле применяют темнопольный конденсор. Он отличается от обыкновенного тем, что весь центр его передней линзы зачернен и в объектив попадают только косые боковые лучи. Микроскопия в темном поле позволяет увидеть объекты, величина которых лежит за пределами обычного микроскопа. Например, можно рассмотреть жгутики бактерий, которые имеют толщину 0,01 мкм. Темнопольная микроскопия не позволяет рассмотреть внутреннее строение бактерий, за исключением их крупных форм, типадрожжей.

Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло – каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора. После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью регулировочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем, с помощью нужного увеличения, переходят к наблюдению.

Метод используют с целью исследования живых клеток

микроорганизмов.

5. Фазово-контрастная микроскопия

Метод фазового контраста связан с изменением условий освещения при наблюдении слабоконтрастных биологических объектов (микроорганизмов) в неокрашенном состоянии с целью их визуализации (контрастирования). В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего прозрачные микроорганизмы становятся видимыми.