Опыт разработки гепатопротекторов природного происхождения научной школой профессора А.С. Саратикова
The experience of the development of hepatoprotectors of nature origin by the scientific school of professor A.S. Saratikov
гепатопротективный природный лекарственное средство
Венгеровский А.И., Чучалин В.С., Буркова В.Н., Федореев С.А.
Сибирский государственный медицинский университет, ООО «Биолит»
Гепатопротекторы сформировались как самостоятельная фармакологическая группа специфических средств профилактики и лечения нарушений функций печени в начале 1980-х гг. Появление таких препаратов связано с широким распространением заболеваний гепатобилиарной системы и разнообразием их этиологии. Первые и наиболее известные до настоящего времени гепатопротекторы -- силимарин, эссенциале и их аналоги. Все они являются импортными, дорогостоящими, хотя и не всегда достаточно эффективными.
В Сибирском государственном медицинском университете (г. Томск) под руководством профессора Альберта Самойловича Саратикова совместно с Томским НИИ химии нефти ТНЦ СО РАН (г. Томск), Иркутским институтом органической химии СО РАН (г. Иркутск), Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН (г. Владивосток) изучены и внедрены в клиническую практику оригинальные гепатопротекторы лохеин, максар и эплир.
Лохеин -- экстракт травы интродуцированного сибирского растения солянки холмовой. Растение выбрано для изучения на основании данных известной сибирской целительницы Елены Васильевны Лохе.
Максар -- комплекс полифенолов ядровой древесины дальневосточного растения маакии амурской. Название препарата является производным от фамилий руководителей исследований -- профессоров О.Б. Максимова и А.С. Саратикова.
Эплир получают из илового осадка озер Западной Сибири, непригодного для бальнеотерапии. Наибольшим лечебным действием обладает фракция полярных липидов. Название препарата образовано из первых букв английского обозначения этой фракции -- Extract Polar Lipids Rock.
На первом этапе создания новых гепатопротекторов были выявлены их перспективные сырьевые источники и разработана ресурсосберегающая технология получения стандартизированных субстанций. Гепатопротективное действие лохеина обусловлено переходом в экстракт глицинбетаина, алкалоидов изохинолиновой структуры, солей фенолкетодикарбоновых кислот, стерингликозидов, сапонинов и флавоноидов. Ведущими веществами маакии амурской являются фенольные соединения -- изофлавоны и полигидроксистильбены. В состав эплира входят фосфолипиды, глицерофосфатиды, сульфолипиды, гликолипиды, ксантофиллы, каротины и желчные кислоты.
Терапевтическая активность указанных соединений при введении животным даже в более высоких дозах, чем их содержание в экстрактах, была ниже эффекта суммарных препаратов. В составе гепатопротекторов возникает синергизм биологически активных веществ.
На основании результатов комплексного химического и фармакологического исследования солянки холмовой установлены вид сырья, рациональные сроки его заготовки и условия культивирования растения. Экстракты, полученные из интродуцированного и дикорастущего растений, характеризуются близким содержанием действующих веществ (глицинбетаины, алкалоиды, флавоноиды) и одинаковой гепатопротективной активностью. С помощью методов многофакторного анализа и математического моделирования выявлены оптимальные параметры экстракции травы солянки холмовой и разработана технология получения лохеина, обеспечивающая наибольший выход биологически активных веществ. Извлечение из надземной части солянки холмовой, измельченной до 3--5 мм, целесообразно проводить 25%-м этанолом способом многоступенчатого экстрагирования с передвижкой извлечений через 6 ч. Трава солянки холмовой отличается малой насыпной массой, высокими пористостью, поглощаемостью и объемом внутреннего сока, поэтому традиционное для жидких экстрактов соотношение сырья и экстрагента 1: 1 не обеспечивает достаточную степень истощения. Число ступеней экстракции коррелирует с объемом внешнего сока, что позволяет значительно повысить эффективность извлечения без разбавления экстракта. Для обработки данных использована созданная В.С. Чучалиным специализированная компьютерная программа. С ее помощью рассчитаны параметры экстрагирования, при которых возрастает эффективность извлечения с сохранением показателей качества готового продукта.
В частности, при увеличении соотношения фаз с 2 до 2,6 эффективность экстракции повышается на 13,5%, при этом величина сухого остатка обеспечивается дополнительной ступенью экстракции.
Субстанцией для получения максара служит полифенольный комплекс маакии амурской. Технология его выделения разработана в лаборатории природных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.
Важным этапом разработки эплира являлась оценка биологической ценности и эксплуатационных возможностей субаквальных осадков озер Западной Сибири с целью выбора перспективных источников сырья. В качестве экстрагента рационально использовать смесь хлороформа и этанола в соотношении 1: 1, обеспечивающую высокий выход полярных липидов, каротиноидов и хлорофиллов с сохранением их антиоксидантных свойств. Методом полного факторного эксперимента установлены оптимальные параметры экстракции: время настаивания -- 3 ч, соотношение фаз -- 1: 16, число ступеней экстракции -- 3, температура -- не выше 60 С. Экстракцию целесообразно проводить во взвешенном слое многоступенчато или методом центробежной динамической экстракции.
В качестве модели для оценки эффективности и изучения механизма действия гепатопротекторов использовали поражение печени гепатотоксинами с различным механизмом патогенного действия (тетрахлорметан, парацетамол, аллиловый спирт, D-галактозамин). У животных, защищенных с помощью лохеина, максара и эплира от повреждающего действия гепатотоксинов, не возникали типичные для гепатита патологические изменения -- дискомплексация печеночных пластинок, воспалительная инфильтрация, значительно слабее была выражена белковая (зернистая, гидропическая) и жировая дистрофия паренхимы печени, уменьшалось количество некротизированных гепатоцитов. Гепатопротекторы ослабляли также ультраструктурные и гистоэнзимологические нарушения в гепатоцитах. В результате гепатопротективной терапии в значительно меньшей степени, чем при токсическом гепатите, снижалась активность митохондриальных дегидрогеназ, маркера эндоплазматического ретикулума -- глюкозо-6-фосфатазы, не повышалась активность лизосомального фермента кислой фосфатазы, в эндотелии синусоидов, центральной вены и эпителии желчных канальцев определялась нормальная активность щелочной фосфатазы. При интоксикации тетрахлорметаном и парацетамолом лохеин, максар и эплир уменьшали деструкцию наиболее уязвимых центролобулярных клеток печени; при отравлении аллиловым спиртом защищали от повреждения перипортальные гепатоциты.
Гепатопротекторы, улучшая барьерную функцию мембран, препятствовали развитию гиперферментемии -- диффузии из гепатоцитов в кровь аминотрансфераз, кислой фосфатазы, фосфолипазы А2, в наибольшей степени снижали в крови активность печеночноспецифических ферментов -- уроканиназы и лактатдегидрогеназы.
Под влиянием гепатопротекторов значительно уменьшалась интенсивность перекисного окисления липидов в печени, вызываемая гепатотоксинами. Полифенолы лохеина и максара, каротиноиды эплира превращают гидроперекиси полиеновых жирных кислот в нетоксические оксикислоты. Фосфолипиды эплира препятствуют изменениям белок-липидных взаимодействий и воссоздают нормальную структуру мембран. Это затрудняет доступ свободных радикалов и реакционноспособных метаболитов -- продуктов биотрансформации гепатотоксинов, а также активных форм кислорода вглубь мембран, к полиеновым жирным кислотам. При терапии острого токсического гепатита в микросомах, митохондриях и гомогенате печени нормализовались количество диеновых конъюгатов, оснований Шиффа и скорость накопления малонового диальдегида. Гепатопротекторы, включаясь в реакции липопероксидации как прямые ингибиторы свободных радикалов, потенцировали действие эндогенных антиоксидантных систем (витамин Е, система глутатиона). Препараты также поставляют антиоксиданты (токоферолы, фосфолипиды, тиолы) в поврежденные мембраны паренхимы печени.
Значительный вклад в лечебный эффект гепатопротекторов вносит их влияние на содержание, спектр и функциональную активность фосфолипидов в мембранах гепатоцитов. При моделях острого токсического гепатита лохеин, максар и эплир повышали в микросомах и митохондриях печени суммарное содержание фосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, тормозили образование лизофосфатидилхолина -- детергентного продукта, формирующего в толще мембран рыхлые мицеллярные структуры. В митохондриях гепатопротекторы уменьшали освобождение кардиолипина. В механизме этих эффектов имеют значение ингибирование перекисного окисления липидов и снижение активности фосфолипазы А2.
Приоритетным механизмом лечебного действия гепатопротекторов является восстановление нарушенной антитоксической функции печени. Терапия токсического гепатита с помощью лохеина, максара и эплира в разной степени повышала активность системы гидроксилирования и деятельность дыхательной цепи эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. В микросомах сохранялся каталитически активный и стабильный цитохром Р-450. Содержание этого гемопротеина достигало 75--95% от нормальной величины и становилось в 1,6--2 раза больше, чем при нелеченном токсическом гепатите. Соотношение цитохрома Р-450 и функционально инертного цитохрома Р-420 при введении гепатопротекторов составляло, как и в норме, 70--80 и 30--20%. Наиболее полноценную реабилитацию реакций метаболической трансформации вызывали максар и эплир.
Терапевтическое влияние гепатопротекторов на нарушенные реакции детоксикации обусловлено подавлением перекисного окисления липидов и репарацией мембран эндоплазматического ретикулума. Максар обладает свойствами слабого индуктора цитохрома Р-450. Эплир поставляет в мембраны фосфолипиды для замены поврежденных молекул. Как известно, цитохром Р-450 является гидрофобным ферментом с трансмембранной локализацией в эндоплазматическом ретикулуме. Гидрофобная поверхность, создаваемая -спиралью пептидной цепи, стабилизирует структуру цитохрома в каталитически активном состоянии за счет многоточечных контактов с мембранными фосфолипидами. Гепатопротекторы также нормализовали каталитическую функцию ферментов конъюгации -- УДФ-глюкуронилтрансферазы и глутатион-S-трансферазы, стимулировали экскрецию конъюгированного с глюкуроновой кислотой билирубина.
При экспериментальном хроническом поражении печени, вызванном у крыс введением тетрахлорметана в течение 30 дней, лохеин, максар и эплир препятствовали дискомплексации печеночных пластинок, развитию дистрофии, колликвационного некроза гепатоцитов, гиперферментемии и неконъюгированной гипербилирубинемии, оказывали выраженный антиоксидантный эффект. В паренхиме печени защищенных гепатопротекторами животных возрастало до нормы количество РНК, сульфгидрильных групп и гликогена. Лимфоидно-гистиоцитарные инфильтраты и фиброзные септы не проникали внутрь печеночных долек.
В пределах портальных трактов соединительная ткань занимала 1,2--1,8% площади среза (при хроническом гепатите -- 12,3%).
Продукты липопероксидации и распада белка, освобождающиеся из некротизированных гепатоцитов, стимулируют фиброгенез в печени при хроническом гепатите. Были выявлены умеренные и сильные корреляционные отношения между процессами перекисного окисления липидов (содержание оснований Шиффа и интенсивность продукции малонового диальдегида), развитием некроза гепатоцитов, с одной стороны, и разрастанием соединительной ткани в печеночных дольках -- с другой. Хроническая интоксикация тетрахлорметаном сопровождалась двукратным увеличением количества гликозаминогликанов, ростом в 1,7 раза содержания маркера коллагена -- аминокислоты оксипролина. Особенно значительно повышалось количество оксипролина в кислоторастворимом и кислотоустойчивом коллагене. Гепатопротекторы, оказывая антиоксидантное и антинекротическое влияние, нормализовали содержание гликозаминогликанов и оксипролина во фракциях коллагена, включая его кислотоустойчивую форму.
Новым направлением исследований гепатопротекторов стало изучение их действия при экспериментальном ингибировании в-окисления жирных кислот и патологии поджелудочной железы. Дефект в-окисления жирных кислот в печени возникает при синдроме Рейе (энцефалопатия и жировая дистрофия печени как осложнение приема салицилатов и вальпроатов на фоне вирусной инфекции у детей), сахарном диабете, алкогольной патологии, наследственных энзимопатиях. В проведенных экспериментах в качестве ингибитора в-окисления использовали 4-пентеноевую (аллилуксусную) кислоту. Этот гепатотоксин, вызывая ацилирование карнитина и его экскрецию с мочой, нарушает транспорт средне- и длинноцепочечных жирных кислот в митохондрии гепатоцитов. В остром периоде нарушения в-окисления жирных кислот летальность крыс достигала 20%, развивалась гиперферментемия, в крови снижалось количество глюкозы, кетоновых тел (ацетон, -оксимасляная кислота), мочевины, возрастало содержание неконъюгированного билирубина, аммиака и фенолов. В гомогенатах печени возникал дефицит кетоновых тел, накапливались аммиак и продукты перекисного окисления липидов -- диеновые конъюгаты, основания Шиффа и малоновый диальдегид, в митохондриях уменьшалась активность сукцинат- и НАД-зависимого путей окисления, разобщалось окислительное фосфорилирование. При гистологическом исследовании печени выявлялись дискомплексация печеночных пластинок, дисциркуляторные расстройства в системе синусоидов, зональные некрозы, белковая и жировая дистрофия паренхимы.