Статья: Оценка уровня нитрита - метаболита оксида азота - у лошадей с симптомокомплексом колик методом ЭПР-спектроскопии

Оценка уровня нитрита - метаболита оксида азота - у лошадей с симптомокомплексом колик методом ЭПР-спектроскопии

З.С. Артюшина, П.Н. Абрамов, Н.Б. Полянский, Н.А. Ткачев, В.А. Сереженков

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Институт химической физики имени Н.Н. Семенова РАН

Аннотация. Патогенез заболеваний пищеварительного тракта лошадей, сопровождаемых развитием воспаления и окислительного стресса, может быть связан с недостатком монооксида азота (N0), управляющего множеством сигнальных путей в организме. Монооксид азота (N0) принимает участие в работе иммунной и нервной систем, его уровень непосредственно определяет тонус всех сосудов и течение многих патологических процессов, N0 следует отнести к числу наиболее важных факторов защиты слизистой желудка и кишечника. В работе подробно освещена методика определения уровня нитрита -- метаболита оксида азота -- при заболеваниях лошадей с симптомокомплексом истинных колик, а также приведены результаты измерений нитрита в сыворотке здоровых животных двух возрастных групп: 1--5 лет и 6--25 лет и животных с патологией. Концентрация нитрита в сыворотке крови у лошадей возрастной группы 6--25 лет составила 3,42 ± 4,22 мкМ, при этом у молодых животных (1--5 лет) уровень этого показателя был 8,24 ± ± 5,42 мкМ, что в 2,4 раза выше. Резкое снижение нитрита отмечено у всех лошадей с заболеваниями кишечника 2,07 ± 0,90 мкМ, особенно при метеоризме 0,6 ± 0,4 мкМ и спастических коликах 1,78 ± 0,5 мкМ. Данные факты обуславливают диагностическую и прогностическую ценность оксида азота как биомаркера регуляции перистальтики кишечника в норме и при патологии.

Ключевые слова: лошадь, колики, ЭПР-спектроскопия, нитрит, оксид азота, нитрозотиолы, динитрозильные комплексы железа, нитрозогемоглобин

ASSESSMENT OF NITRITE LEVEL - NITRIC OXIDE DERIVATIVE - IN HORSES WITH INTESTINAL COLIC BY ESR SPECTROSCOPY

Zinaida S. Artyushina1, Pavel N. Abramov, Nikolai B. Polyansky, Nikolai A. Tkachev, Vladimir A. Serezhenkov

Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology named K.I. Skryabin. Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences. Semenov Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences

Abstract. The pathogenesis of diseases of the digestive tract of horses, accompanied by the development of inflammation and oxidative stress, can be associated with a lack of nitrogen monoxide, which controls a variety of signaling pathways in the body. Nitrogen monoxide (NO) takes part in the work of the immune and nervous systems, its level directly determines the tone of all blood vessels and the course of many pathological processes. NO should be considered as one of the most important factors in the protection of the gastric and intestinal mucosa. The article describes in detail the method for determining the level of nitrite-nitric oxide metabolite -- in diseases of horses with the symptom complex of “true” colic, and also presents the results of measurements of nitrite in the serum of healthy animals of two age groups: 1--5 years and 6--25 years and animals with pathology. The concentration of nitrite in blood serum in horses of the age group of 6--25 years was 3.42 ± 4.22 pM, while in young animals (1--5 years) the level of this indicator was 8.24 ± 5.42 pM, which is 2,4 times higher. A sharp decrease of nitrite was noted in all horses with intestinal diseases of 2.07 ± 0.9 pM, especially with meteorism 0.6 ± 0.4 pM and spastic colic 1.78 ± 0.5 pM. These facts determine the diagnostic and prognostic value of nitric oxide as a biomarker for the regulation of intestinal motility in normal and pathological conditions.

Keywords: horse, intestinal colic, ESR-spectroscopy, nitrite, nitric oxide, nitrosothioles, dinitrosyl, iron complexes, nitrosyl hemoglobin

Актуальность

Диагностика, профилактика и лечение заболеваний лошадей, протекающих с симптомокомплексом истинных колик -- одна из актуальных проблем ветеринарной медицины, поскольку они сопровождаются высокой смертностью животных и наносят значительный экономический ущерб.

Широкая распространенность заболеваний желудка и кишечника у лошадей, сложность и многогранность патогенеза, а также недостаточная освещенность вопросов дифференциальной диагностики актуализируют данную тему, требующую дальнейшего изучения, обуславливая ее высокую практическую и теоретическую значимость.

Заболевания пищеварительного аппарата лошадей имеют острый характер течения, обусловленный скрыто протекающими процессами (воспалительные явления, и как результат -- развитие окислительного стресса -- гиперпродукции активных форм кислорода), по причине возраста, физических нагрузок, кормления, наследственных факторов конкретного животного. По мнению ряда исследователей, в процессе патогенеза может снижаться уровень оксида азота, необходимого для нормальной работы как эндотелия сосудов и сфинктеров, так и органов в целом.

Монооксид азота (NO) наряду с двумя другими газообразными мессенджерами (СО и H2S) принимает участие в работе иммунной и нервной систем, его уровень непосредственно определяет тонус сосудов и течение многих патологических процессов в организме. Особые физико-химические свойства данной молекулы определили способ ее транспортировки -- в форме нитрозильных комплексов с гемовым железом, нитрозотиоловRSNO, а также высоко- и низкомолекулярных комплексов с негемовым железом с тиоловыми лигандами [1]. Это так называемые «комплексы 2.03» -- моно- и биядерныединитрозильные комплексы (ДНКЖ).

NO синтезируется in vivoиз L-аргинина под действием NO-синтетазы(NOS). NO модулирует активность белков посредством S-нитрозилирования: воздействию (NO+) подвергаются цистеиновые остатки. Синтез нитрозотиолов (RSNO) -- регулируемая посттрансляционная модификация белка. Образование белковых динит-розильных комплексов при связывании тиоловыми группами железа (II) с NO также представляет собой форму посттрансляционного регулирования их активности. Один из наиболее распространенных методов при оценке степени воспалительного процесса -- измерение уровня нитрата с использованием так называемого реактива Грисса -- нельзя считать корректным, поскольку нитрат имеет различные источники происхождения в организме. В литературе также имеются данные об измерении концентрации нитрозотиолов(RSNO) [2].

Этот подход еще более спорный, в связи с большими методологическими трудностями их измерений, что приводит к разбросу данных в физиологических жидкостях и тканях здоровых животных до 10000 раз (от 1 нМ до 7 мкМ). В доступной литературе мы нашли публикации, связанные с измерением нитрата в сыворотке лошадей для оценки степени тяжести заболеваний [3].

Несмотря на очевидные показатели заболеваний у животных, оценка уровня нитрата не позволяла дифференцировать норму от патологии даже в случае исследования больших выборок животных [4]. Наиболее корректной оценкой уровня оксида азота в организме как в норме, так и при патологических состояниях следует считать измерение продукта его метаболизирования-- нитрита [5, 6].

Поэтому целью нашей работы, исходя из анализа литературных сведений о возможной связи уровня оксида азота в сыворотке крови у лошадей с симпто-мокоплексом колик и характером патологических изменений функций пищеварительного аппарата в целом стало измерение уровня метаболита NO -- нитрита методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спиновых ловушек [7].

Материалы и методы исследования

симптомокомплекс ветеринарный лошадь

Объектом исследования служили лошади в количестве 38 голов, при клиническом исследовании которых 8-ми был поставлен диагноз: катаральный спазм, закупорка большой ободочной кишки, колит, перемещение большой ободочной кишки, метеоризм.

С железом гемоглобина NO образует долгоживущие комплексы, позволяющие определять его непосредственно в образцах крови методом ЭПР. Для определения NO сыворотке мы использовали метод спиновых ловушек, основанный на применении дитиокарбамата и железа (II).

Для исследования брали кровь из яремной вены в пробирки с гепарином и центрифугировали в течение 10 минут на центрифуге модели CH80-2S «Armed» со скоростью 3000 об/мин для осаждения эритроцитов. После чего образцы сыворотки хранили в жидком азоте (-196 °C). Для измерения концентрации нитрозо- гемоглобина была использована цельная кровь. Сигналы ЭПР регистрировали на спектрометре фирмы «Брукер» (ФРГ) ECS-106.

Метод определения NO, используемый в данной работе, основан на реакции образования нитрозотиола -- нитрозоцистеина(RSNO) в кислой среде (рН = 3,5) из аниона нитрита NO2-и гидрохлорида цистеина. Затем нитрозоцистеин в присутствии железа (2+) и №метил-Б,Ь-глюкаминдитиокарбамата (МГД) (ловушка) образует водорастворимый парамагнитный мононитрозильный комплекс железа МНКЖ МГД-Fe-NO. Определение аниона нитрита NO2проводили следующим образом: белки сыворотки после разморозки удаляли фильтрованием через фильтр Microcon, Millipore Corporation, USA в течение 20 минут при 14 500 об/мин на центрифуге Mini Spin plus, Eppendorf.

Разработанный нами метод позволяет, во-первых, контролировать влияние белков сыворотки на реакцию образования МНКЖ МГД; и, во-вторых, учесть вклад высокомолекулярных RSNO как дополнительного источника нитрита.

К 50 мкл цистеина концентрацией 400 мМ добавляли 10--120 мкл сыворотки, рН раствора доводили до 3,5 добавлением 0,01 мМHCl. Спустя 5 минут добавляли 50 мкл 40 мМ сульфата железа (II), 200 мкл 400 мМ буфера (Трис или Hepes) и 200 мкл МГД концентрацией 250 мМ. Затем рН раствора повышали до 7,6 0,06%-ным раствором NaOH. В этих условиях образуется МНКЖ МГД-Fe-NO.

Для построения калибровочной кривой к 50 мкл цистеина гидрохлорида концентрацией 400 мМ добавляли раствор нитрита натрия концентрацией 480 мкМ разного объема (2--40 мкл), рН раствора доводили до 3,5 добавлением 0,01 мМHCl. Спустя 5 минут добавляли 50 мкл40 мМ железа сульфата, 200 мкл200 мМ (Трис или Hepes), 200 мкл 250 мМ МГД, pH доводили до 7,6 0,06%-ным раствором NaOH. Через 10 мин записывали ЭРО спектр МНКЖ МГД-Fe-NO. Оценку концентрации нитрита в образце производили методом двойного интегрирования и сопоставления площадей ЭПР-сигналов исследуемого и стандартного образца. В качестве последнего использовали синтезированный комплекс МГД с железом (2+) и оксидом азота: МНКЖ МГД-Fe-NO. На рис. 1 представлена зависимость интенсивности ЭПР-сигнала от концентрации нитрита [С] = 0,134 I -- 0,024. Коэффициент корреляции r= 0,984 (метод Спирмена). Расчеты производились с помощью программного обеспечения ЭПР-спектрометра Bruker ECS-106.

Результаты

На рис. 1 показана зависимость интенсивности ЭПР-сигнала (площадь подынтегральной кривой) от концентрации нитрита в диапазоне 0,3-- 1,6 мкМ в образце после удаления сывороточных белков центрифугированием.

Рис. 1

Используя построенную калибровочную кривую, были проведены измерения содержания нитрита в образцах сыворотки животных, что отражено в табл. 1.

Таблица 1. Концентрация нитрита в сыворотке и нитрозогемоглобина в цельной крови лошади

В таблице 1 приведены результаты измерений нитрита в сыворотке здоровых животных 2 возрастных групп 1--5 лет и 6--25 лет, а также 8 животных с патологией. Результаты статистической обработки полученных данных приведены в табл. 2.

Таблица 2

Для оценки степени различия использовали анализ формы распределения (тест Колмогорова) и сравнение медианы и среднего (тест Манна--Уитни и тест Стьюдента соответственно). Анализ показал значимые отличия по всем исследованным параметрам для возрастных и болеющих лошадей от молодых (р = 0,0484 и 0,0108; 0,0074 и 0,0391), тогда как между выборками возрастных и болеющих различия незначимы (р = 0,6547 и 0,2500).

Рис. 2. Спектры ЭПР комплекса N-метил-Р, L-глюкам индитиокарбамата (МГД) с железом (2+) и оксидом азота МНКЖ МГД FeNOв сыворотке лошадей: Условия записи спектров: Х-диапазон, центр поля 334 мТ, развертка 10 мТ, амплитуда модуляции 5 Гс, мощность СВЧ 20 мВт. Усиление 1-105, 1 накопление, температура 293 К

Обсуждение

N0 следует отнести к числу наиболее важных факторов защиты слизистой ЖКТ [8]. Известна роль N0 как нейромедиатора в неадренергических/нехолинергических нейронах (NANC-нейроны), которые, наряду с холин- и норадренер- гическими проводниками автономной нервной системы, составляют третий тип автономной нервной системы [9, 10]. У лошадей имеются три автономных центра регуляции перистальтики, связанных с интерстициальными клетками Кахаля: гастродуоденальный центр, подвздошно-слепокишечный центр и центр тазового изгиба [10, 11].

Автономная нервная система кишечника использует в качестве нейромедиаторов вазоактивный интестинальный пептид (У1Р) и N0 [11, 12]. Установлено, что оксиду азота принадлежит существенная роль в активации синтеза бикарбонатов, регуляции кровотока и моторики ЖКТ. Показано участие N0 в патологических процессах, протекающих в толстом кишечнике. Эти изменения могут способствовать нарушению моторики и абсорбции в кишечнике.