Материал: Оценка токсичности наночастиц серебра in vitro

Оценка токсичности наночастиц серебра in vitro

Реферат

Курсовая работа 28 страниц, 5 рисунков, 3 таблицы, 20 источников.

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА IN VITRO

Объектом исследований являются наночастицы серебра, методы определения токсичности наночастицы серебра in vitro.

Цель исследования: разработать методологические подходы к определению токсичности наночастицы серебра для гигиенической оценки их безопасности.

В процессе выполнения решались следующие задачи: разработать тест-модель для оценки токсичности наноматериалов in vitro; разработать алгоритм исследований токсичности наноматериалов in vitro; обосновать критерии оценки токсичности наноматериалов in vitro.

В ходе выполненной курсовой работы был выбран вид наноматериала (наночастицы серебра) для проведения тестирования in vitro; определены клеточные линии для изучения цитотоксического действия наночастиц с учетом возможных органов-мишеней; проведен анализ научной литературы, касающейся методических аспектов изучения цитотоксического действия наноматериалов для токсикологической оценки. В экспериментах определены приемлемые диапазоны концентраций наночастиц для тех или иных методов исследования.

Список сокращений

АОЗ - антиоксидантная защита

АФК - активные формы кислорода

АТФ - аденозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НМ - наноматериалы

НЧ - наночастицы

ЦНС - центральная нервная система

ЭФК - эмбриональные фибробласты крысы- эмбриональные фибробласты мыши- (4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2H-тетразолия бромид, редокс-краситель

UFPs - ультратонкие частицы

Оглавление

Введение

1. Наночастицы

1.1 Состояние проблемы

.2 Определение наночастиц

.3 Классификация наночастиц

.4 Свойства наночастиц

.5 Пути поступления и биокинетика наночастиц

.6 Системные эффекты наночастиц

.7 Иисследование цитотоксичности наночастиц

2. Обьекты, методы исследований, приборы, оборудование

2.1 Наночастицы, используемые в экспериментах in vitro

2.1.1 Характеристика наночастиц серебра

2.2 Культуры клеток, используемые для изучения токсичности in vitro

2.2.1 Культура клеток карциномы легкого человека (А549)

.2.2 Культура клеток амниона человека, сублиния FL

.2.3 Культура лимфоцитов человека

.2.4 Культура кардиомиоцитов крыс линии SHR

2.3 Методы изучения цитотоксичности наноматериалов в культурах клеток млекопитающих

2.3.1 Метилтетразолиевый тест

.3.2 Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью окраски трипановым синим (метиленовым синим)

.3.3 Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью определения активности ЛДГ

2.4 Перечень испытательного оборудования

3. Результаты исследований

3.1 Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность клеток линий А549, SHR и сублинии FL по результатам МТТ-теста

.2 Влияние наночастиц на жизнеспособность лимфоцитов человека по результатам МТТ-теста

.3 Изучение цитотоксичности наноматериалов для клеток линии А549 с помощью окраски метиленовым синим

.4 Изучение жизнеспособности клеток в культуре по активности лактатдегидрогеназы в среде культивирования

Заключение

Список литературы

наночастица клетка токсичность vitro

Введение

В последние два десятилетия в научную лексику стремительно "ворвались" ряд новых слов с префиксом "нано": наноструктура, нанотехнология, наноматериал, нанокластер, нанохимия, наноразмерный материал, наноколлоиды, нанореактор и т.п. Издается ряд новых журналов, посвященных исключительно этой тематике, появились монографии, в названии которых присутствует префикс "нано", а также "нано"-профилированные институты, кафедры и отдельные лаборатории, проводятся многочисленные конференции. В настоящее время в Республике Беларусь выполняется Государственная комплексная программа "Нанотехнологии и наноматериалы", которая предполагает разработку сверхтвердых, тугоплавких, магнитных и композиционных наноматериалов, наноэлектроники, а также изучение физико-химических особенностей наноразмерных величин. Детально изучается влияние нанодобавок на свойства металлов, сплавов, пластмасс, резины, керамики. Преимущество модифицированных материалов - в их высокой прочности и износостойкости, а также хорошем коэффициенте трения.

Разработка новых наноматериалов, рост производства и расширение возможностей их применения неминуемо приведет к увеличению их воздействия на население и окружающую среду. Становится очевидным, что для обеспечения безопасного обращения наноматериалов необходимо понимание возможных эффектов производимых и используемых в различных товарах наноматериалов на различных уровнях организации живых систем, характеристика воздействия и оценка риска на каждом этапе жизненного цикла товара или материала. Важная составляющая таких знаний - результаты токсикологической оценки наночастиц, а именно выявление зависимостей доза-эффект, доза-время-эффект с учетом природы и размера наночастиц, что является предметом изучения нанотоксикологии.

1. Наночастицы

.1      Состояние проблемы

Число наименований наноматериалов и объемы их применения в различных областях науки, медицины, энергетики, промышленности стремительно растут. Скорость развития нанотехнологий опережает разработку методов оценки их безопасности и регламентирующих документов [1]. В настоящее время практически не проводятся исследования потенциальных токсических свойств наноматериалов.

Негативные эффекты наночастиц зависят от пути воздействия и включают цитотоксичность, развитие неспецифических воспалительных реакций и окислительного стресса, онкогенность.

Оценка токсического действия наночастиц различного химического состава и структуры является актуальной и своевременной. Установление принципов и процедур тестирования с целью обеспечить безопасное производство и применение наноматериалов на рынке необходимо и достижимо [2]. Исследования с целью разработки адекватных подходов к прогнозу риска влияния наночастиц на здоровье человека с учетом химической структуры, размеров, формы, физико-химических свойств, технологии производства и сферы применения на начальном этапе целесообразно проводить in vitro.

Проблема токсического действия наночастиц на живые системы не является абсолютно новой. По определению наночастицы - объекты, один из размеров которых составляет < 100 нм, поэтому к ним можно отнести не только наночастицы, полученные с целью придания заданных свойств, но и ультратонкие частицы природного происхождения (UFP), например, асбестовые волокна, частицы, возникшие в результате вулканической деятельности, горения лесов, а также антропогенной деятельности - в результате сгорания топлива, курения. Эффекты, вызываемые наночастицами, независимо от их происхождения, схожи.

.2      Определение наночастиц

Термин ≪наночастица≫ или ≪наноразмерная частица≫ прочно вошел в научный лексикон около 20 лет назад, однако критерий наноразмерности до сих пор является предметом многих научных дискуссий.

Нано-объект - это физический объект исследований (и разработок), размеры которого принято измерять в нанометрах.

Нанотехнология имеет дело как с отдельными нано-объектами, так и с материалами на их основе, а также процессами на нано-уровне. К наноматериалам относятся такие материалы, основные физические характеристики которых определяются содержащимися в них нанообъектами.

Наноматериалы делятся на компактные материалы и нанодисперсии; к первым относятся так называемые "наноструктурированные" материалы [3], т.е. изотропные по макросоставу материалы, повторяющимися элементами, структуры которых являются группировки (области), имеющие размеры нескольких нанометров, иногда десятки нанометров и более [4]; иными словами, наноструктурированные материалы состоят из непосредственно контактирующих между собой нанообъектов. В отличие от этого, нанодисперсии состоят из среды диспергирования (вакуум, газ, жидкость или твёрдое тело), в которой распределены изолированные друг от друга нано-объекты. Расстояние между нано-объектами в нанодисперсиях может меняться в достаточно широких пределах от десятков нанометров до долей нанометра; в последнем случае мы имеем дело с нанопорошками, где нано-объекты разделены тонкими (часто - моноатомными) слоями из лёгких атомов, препятствущих их агломерации.

Наночастица - это квази-нульмерный нанообъект, у которого все характерные линейные размеры имеют один порядок величины; как правило, наночастицы имеют сфероидальную форму; если в наночастице наблюдается ярко выраженное упорядоченное расположение атомов (или ионов), то такие наночастицы называют нанокристаллитами. Наночастицы с выраженной дискретностью системы уровней энергии часто называют "квантовыми точками" или "искусственными атомами"; чаще всего они имеют состав типичных полупроводниковых материалов[5].

.3      Классификация наночастиц

Согласно международной конвенции IUPAC, предельный (максимальный) размер наночастиц соответствует 100 нм, хотя эта величина является чисто условной и необходима только для формальной классификации. Различают два типа наночастиц: нанокластеры, или нанокристаллы, и собственно наночастицы. К первому типу относят частицы упорядоченного строения (часто центросимметричные) размером 1−5 нм, содержащие до 1000 атомов, ко второму- собственно наночастицы размером 5−100 нм, состоящие из 103−108 атомов. Нитевидные и пластинчатые частицы могут содержать гораздо большее количество атомов и иметь один или даже два линейных размера, пре-вышающих пороговое значение, но их свойства в определенном направлении остаются характерными для вещества в нанокристаллическом состоянии. Если наночастица имеет сложную форму и строение, то в качестве характеристического рассматривают не линейный размер частицы в целом, а размер ее структурного элемента. Такие частицы, как правило, называют наноструктурами, причем их линейные размеры могут значительно превышать 100 нм.

Различия в линейных размерах наночастиц делают целесообразным подразделять их на нуль-,одно-, двух- и трехмерные (соответственно, 0D-, 1D-, 2D- и 3D-наночастицы). К нульмерным наноструктурам относят свободные и стабилизированные кластеры, фуллерены и эндофуллерены и квантовые точки. Класс одномерных наноструктур представлен гораздо бoльшим разнообразием нанообъектов: это наностержни, нанонити (вискеры), нанотрубки и наноленты. Среди двумерных наноструктур выделяют тонкие пленки толщиной до сотен нанометров, гетероструктуры, пленки Лэнгмюра−Блоджетт, нанопластины, адсорбционные и самособирающиеся монослои, а также двумерные массивы объектов, размеры которых лежат в нанометровом диапазоне. К классу трехмерных наноструктур следует относить как сами наночастицы и наночастицы в оболочке, так и нанокомпозиты и трехмерные самоорганизованные массивы нанообъектов. При этом сами композиты могут включать нуль-, одно- и двумерные объекты, то есть представлять собой массивы квантовых точек, нитей, многослойные пленки или слоистые соединения, а также различные комбинации этих типов наноструктур. На наноуровне оказалось возможным и существование структур промежуточной размерности, т.н. фракталов и дендримеров, обладающих самоподобием и рассматривавшихся ранее лишь в качестве математических моделей.

В последние годы большие усилия исследователей направлены на получение наночастиц заранее заданных формы и размера, а следовательно, обладающих определенными физико-химическими свойствами - описано множество различных синтетических подходов, каждый из которых обладает своими преимуществами, но и не лишен определенных недостатков. Сегодня все методы получения наноматериалов разделяют на две большие группы по типу формирования наноструктур: методы снизу-вверх (Bottomup) характеризуются ростом наночастиц или сборкой наночастиц из отдельных атомов; а методы сверху-вниз (Top-down) основаны на дроблении частиц до наноразмеров.[6]

.4     
Свойства наночастиц

Малые размеры наночастиц приводят к многократному увеличению удельной поверхность материалов, что способствует транзиту самых различных веществ за счет увеличения адсорбционной емкости. Возрастает химическая реакционная способность и каталитические свойства вещества. На эти параметры прямо влияют также физико-химические свойства, включая форму, поверхностную структуру, полярность. Поэтому увеличивается вероятность развития различных процессов внутри отдельных клеточных структур: органелл, биологических мембран, проникновение и контакт с клеточным ядром и ДНК. Во многом цитотоксические свойства наночастиц объясняются их способностью к агрегации внутри клеток[7].

По информации, имеющейся в международной базе данных, количество зарегистрированных наименований наноматериалов в настоящее время превысило 2900, среди них 714 - углеродные нанотрубки и 85 - наночастицы серебра. Международные организации и правительства развитых стран проявляют огромный интерес к проблеме развития нанотехнологий.

.5      Пути поступления и биокинетика наночастиц

Большинство исследований по оценке биологического действия наночастиц проводились на млекопитающих и были направлены на изучение эффектов со стороны дыхательной системы. Однако имеются и другие пути воздействия, такие как кожа, желудочно-кишечный тракт (рисунок 1).

Рисунок 1 - Биокинетика наночастиц в организме

Следует принимать во внимание тот факт, что механизмы защиты, специфичные для того или иного пути поступления, способные оградить организм от вредных химических веществ, не всегда состоятельны в отношении наночастиц [8]. Необходимо учитывать также, что наночастицы могут попадать в кровеносную систему как из окружающей среды, так и при терапевтических вмешательствах, а также в результате поступления в организм любыми другими путями.

Абсорбция и распределение в органах дыхания. В ходе распределения и удаления в дыхательной системе наночастицы и частицы большего размера ведут себя не одинаково. Основной механизм распределения наночастиц - диффузия при столкновении с молекулами воздуха. Электростатическое осаждение имеет место только в том случае, если наночастицы несут существенный электрический заряд. Наночастицы могут оседать в носоглотке, трахеобронхиальной области и в альвеолах. Имеются защитные механизмы, которые на всем протяжении дыхательных путей обеспечивают освобождение слизистых оболочек от частиц, попадающих при вдыхании. После оседания в дыхательных путях наночастицы легко перемещаются, покидают легкие и достигают других органов-мишеней различными путями и механизмами.

Наиболее важный механизм удаления твердых частиц обеспечивается альвеолярными макрофагами путем фагоцитоза[9]. Однако в экспериментах на крысах было показано, что лишь 20% полистирольных наночастиц было обнаружено в макрофагах, тогда как для частиц диаметром 0,5, 3 и 10 мкм этот показатель составил 80 %. Таким образом, большая часть наночастиц поступает в эпителий и интерстиций.

Результаты исследований ультратонких частиц дыма и наночастиц диоксида титана (TiO2) показали, что наночастицы после оседания в легких путем трансцитоза через эпителий дыхательных путей попадают в интерстиций. Так как проникновение наночастиц через альвеолярный эпителий в большей мере характерно для крупных млекопитающих (собаки, приматы), чем для грызунов, такой путь имеет место в организме человека. Достигнув межклеточного пространства в легких, наночастицы попадают в кровеносную и лимфатическую систему. При интратрахеальном введении крысам наночастиц золота обнаружено, что через 30 минут после воздействия большая часть наночастиц аккумулировалась в тромбоцитах легочных капилляров. Транслокация через эпителиальные и эндотелиальные мембраны определяется размером частиц, физико-химическими свойствами поверхности и, возможно, зарядом[10].

Альбумин, наиболее распространенный белок в плазме и интерстиции, способствует эндоцитозу наночастиц подобно лецитину и фосфолипидам. Так, например, частицы полистирола размером 240 нм проникали через альвеолярно-капиллярный барьер в том случае, если были покрыты лецитином. Поэтому одновременное присутствие альбумина и фосфолипидов на поверхности альвеолярного эпителия может быть важным фактором, облегчающим поглощение наночастиц эпителиальными клетками после распределения в альвеолярном пространстве.