Материал: Нитрифицирующие прокариоты

Нитрифицирующие прокариоты

Курсовая работа

Нитрифицирующие прокариоты

Введение

прокариота хемолитотрофный бактерия нитрификация

Биосфера заселена огромным числом живых существ. Одни из них составляют макромир, другие - микромир. К макромиру относятся животные, птицы, растения, насекомые и другие видимые невооруженным глазом существа; микромиру принадлежат не видимые невооруженным глазом мельчайшие живые существа, имеющие как растительное, так и животное происхождение; это главным образом бактерии, грибы, простейшие и вирусы. По ориентировочным подсчетам, в биосфере обитает не менее 1030 бактерий, а число вирусов, простейших не поддается учету.

Микроорганизмы в зависимости от молекулярно-биологической организации подразделяют на прокариотов и эукариотов. Прокариоты (от греч. karyon - ядро) доядерные простейшие одноклеточные формы жизни, не имеющие ядерной мембраны и высокоорганизованных органелл.

Особое место среди прокариотов занимают нитрифицирующие бактерии (лат nitro - азот и faceo - делаю).

1. Научная классификация

.1      Принципы классификации прокариот

В настоящее время в микробиологии существует два различных подхода к систематике, обуславливающие два принципа классификации. Одни исследователи считают, что классификация должна отражать историю развития организмов и строиться на филогенетической основе. Это естественная классификация. В 1936-1950 гг. исследователи голландской школы А. Юпойвер, К. ван Ниль и Р. Стейниер разрабатывали филогенетические подходы к систематике бактерий. Второй подход к систематике основан на учете легко определяемых признаков, удобных с точки зрения практики. Это искусственная, или традиционная классификация. Она чаще всего заранее подчинена конкретным задачам. При такой классификации признаки, определяющие принадлежность организма к той или иной таксономической единице, часто выбираются произвольно. Иногда микроорганизмы объединяются в группы на основании одного ведущего признака. Поэтому группы микроорганизмов, классифицированные по данной систематике, могут иметь большое практическое значение, но не соответствуют естественной классификации. Искусственная классификация положена в основу определителя Берги, предназначенного для идентификации бактерий по фенотипическим признакам и содержит сведения о видах бактерий [8].

Основой определения систематического положения являются: морфология и тинкториальные свойства клеток (форма, размеры, взаимное расположение, спорообразование, окраска по методу Грама и другими методами), культуральные, биохимические, антигенные характеристики, а также чувствительность к различным антимикробным воздействиям и степень генетического родства с представителями других таксонов (по процентному соотношению содержания гуанина и цитозина в геноме, гомологии нуклеиновых кислот и способности к обмену генетической информацией), патогенность и вирулентность, степень опасности для человека [5, 20].

Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид и подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны - группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам. Названия микроорганизмов регламентируются Международным кодексом номенклатуры бактерий. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т.е. состоит из двух слов. Например, возбудитель брюшного тифа пишется как Salmonella typhi. Первое слово - название рода начинается с прописной буквы, второе слово (название вида) - со строчной. При повторном написании, родовое название сокращается до начальной буквы, например S.typhi [12].

Наиболее употребительными во всем мире были классификации Кауфмана [Kauffmann F., 1963-1966], позднее Юинга [Ewing W., 1967-1972] [30].

Однако в 1974 г. Вышел капитальный труд, созданный ведущими бактериологами разных стран 8-е издание Bergeys Маnual оf Determinative Bacteriology «Определитель бактерий Берги», где главными критериями для разделения бактерий на крупные таксоны служили морфология, физиология и биохимические свойства, отчасти генетический анализ. Для дифференциации более мелких категорий некоторых бактерий использованы особые признаки - серологические, отношение к бактериофагам и колицинам [30]. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D. Н. Bergey, 1860-1937) [9, 16].

Принципы идентификации, изложенные в Определителе бактерий Берги, 9-е издание которого вышло в 1994 г., нашли наибольшее распространение и признание в практической бактериологии. В настоящее время бактерии классифицируют в соответствии с Определителем Берги, выпускаемом периодически Международным Комитетом по тематике прокариот с привлечением крупных специалистов разных стран. Ценность Определителя Берги в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактерий и содержит необходимые тесты для их идентификации [8]. В СССР был составлен его сокращенный вариант на русском языке - «Краткий определитель бактерий Берги» (1980) [30].

1.2    Научная классификация нитрифицирующих бактерий

В «Определителе бактерий-9» (1984-1989) прокариоты в зависимости от строения клеточной стенки разделены на 17 частей. Нитрифицирующие бактерии относятся к Части 12 - Аэробные хемолитотрофные бактерии и близкие к ним организмы. Группа разделена на 3 подгруппы в зависимости от химической природы окисляемых неорганических соединений [9].

Подгруппа 1: Бесцветные сероокисляющие бактерии. В подгруппе объединены бактерии, способные окислять неорганические восстановленные соединения серы, образуя в качестве конечного продукта сульфат. Семейство Thiobacillaceae. Обитатели почвы, воды, серных ключей или серных месторождений. Их можно обнаружить невооруженным глазом по наличию обильных белых отложений серы, взвесей, тяжей, розеток или пленок.

Подгруппа 2: Железо- и марганец-окисляющие и / или осаждающие бактерии, получают энергию в процессе окисления двухвалентного железа или марганца кислородом воздуха. Семейство Siderocapsaceae и несколько других родов. Они способны откладывать оксиды железа или марганца вне клетки. В основном обитают в железосодержащих водах.

Подгруппа 3: Нитрифицирующие бактерии, получают энергию в процессе окисления аммиака до нитрата. В подгруппу включены бактерии семейства Nitrobacteriaceae.

Процесс окисления аммиакиа до нитрата происходит в два этапа. На первом этапе происходит окисление аммимка до нитритов, а на втором нитриты окисляются до нитратов. Эти два процесса требуют различных наборов нитрифицирующих ферментов и выполняются двумя различными группами бактерий. В зависимости от того, какую фазу процесса осуществляют нитрифицирующие бактерии их причисляют к одной из двух секций. Секция А: окисление аммиака до нитритов производят бактерии родов Nitroso- : роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosospira и др. Секция В: окисление нитритов до нитратов производят бактерии родов Nitro- : Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus [21].

Таким образом, научная классификация нитрифицирующих прокариот выглядит следующим образом:

Царство: Procariotaе

Подцарство (домен): Bacteria

Отдел: Gracilicites

Класс: Scotobacteria

Группа Proteobacteria

Семейство: Nitrobacteriaceae

Секция А

Род: Nitrosomonas

Род: Nitrosospira

Род: Nitrosococcus

Род: Nitrosolobus

Секция В

Род: Nitrobacter

Род: Nitrococcus

Род: Nitrospira

Так же можно придерживаться другой классификацией, по которой нитрифицирущие бактерии относятся к двум типам Nitrospira и Proteobacteria, пяти классам Nitrospira, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Deltaproteobacteria [32]:

Домен Bacteria

Тип Nitrospira или Nitrospirae

Класс Nitrospira

Порядок Nitrospirales

Семейство Nitrospiraceae

Род Nitrospira

Тип Proteobacteria

Класс Alphaproteobacteria

Порядок Rhizobiales

Семейство Bradyrhizobiaceae

Род Nitrobacter

Класс Betaproteobacteria

Порядок Nitrosomonadales

Семейство Nitrosomonadaceae

Род Nitrosolobus

Род Nitrosospira

Род Nitrosomonas

Класс Gammaproteobacteria

Порядок Chromatiales

Семейство Ectothiorhodospiraceae

Род Nitrococcus

Семейство Chromatiaceae

Род Nitrosococcus

Класс Deltaproteobacteria or Deltabacteria

Порядок Desulfobacterales

Семейство Nitrospinaceae

Род Nitrospina

2. Общая характеристика

.1 История открытия

Биологическая природа образования в почве нитратов была установлена во второй половине прошлого века. Предположение об участии микроорганизмов в этом процессе было высказано Л. Пастером. Биологическая сущность процесса нитрификации была доказана работами Т. Шлезинга и А. Мюнца в 1879 г. [6]. В своей работе ни медленно пропускали сточные воды, содержащие аммиак, через длинную трубку, наполненную песком и калием, и установили, что через 20 дней в конце трубки выходил нитрат, а не аммиак; хлороформ или кипяток уничтожали эту способность аммиака к окислению, но при дополнительном внесении почвы этот процесс возобновлялся. Р. Уорингтон (во многих сообщениях 1878 и 1891 года) подтвердил эти открытия и пошел дальше, а именно он доказал участие двух организмов в этом процессе [26].

Однако выделение нитрифицирующих бактерий в чистую культуру и их описание являются заслугой Виноградского (1891 год). Для получения плотной минеральной питательной среды он использовал вместо агара силикагель. Он обнаружил, что в окислении аммония в нитриты и далее нитритов в нитраты принимают участие два различных организма - Nitrosomonas и Nitrobacter. Обе бактерии облигатно автотрофны. Изучением роста этих экзотических бактерий занимался О. Мейергоф (1916, I917). Последующие опыты по выделению бактерий убедили многих почвенных микробиологов в том, что в окислении аммиака в природе литоавтотрофные нитрификаторы занимают монопольное положение [12].

Новые роды, и среди них факультативные автотрофы и миксотрофы были описаны самим Виноградским (1892, 1933) и далее С.В. Уотсоном (в 1965-1975 годах) и Э. Боком с сотрудниками (1962-1975) [3,9].

Иошида и Александер в 1970 г. описали образование N₂O суспензиями клеток Nitrosomonas europaea при окислении аммония и гидроксиламина; при этом до 95% окисленного азота гидроксиламина выделялось в форме N₂O. Авторы сделали вывод, что N₂O образуется из промежуточного продукта нитрификации, дальнейшее превращение которого в нитрит ингибируется аммонием, гидразином и температурой выше 35°С. Следует отметить, что такое значительное образование N₂O было получено только в этой работе для клеток N.europaea, выдержанных в течение нескольких дней на холоду, и в дальнейшем не наблюдалось авторами, создававшими для клеток N.europaea физиологические условия [10].

Отмечено образование N₂O культурой Nitrosospira briensis, растущей в присутствии аммония (Веденина, Заварзин, 1979) [15].

Блэкмер с соавторами (1980) описали выделение N₂O в аэробных условиях из стерильных почв после внесения в них аммония и инокулирования культурами Nitrosomonas, Nitrosospira и Nitrosolobus. В одинаковых условиях наибольшее количество N₂O было получено из почв, инокулированных двумя штаммами Nitrosomonas, и значительно меньшее в случае Nitrosospira и двух штаммов Nitrosolobus. Однако судить о родовых различиях в способности образовывать N₂O нельзя, так как третья из исследованных бактерий - Nitrosomonas sp. - образовывала ничтожные количества N₂O.

В совместных работах лабораторий Ватсона и Мак-Элроя (1980-1981) показана способность к образованию N₂O у представителей 4 родов хемоавтотрофных нитрификаторов - Nitrosomonas europaea, Nitrosococcus oceanus, Nitrosolobus multiformis и Nitrosospira briensis. В условиях низкой аэрации скорость образования NO₂ - жидкой культурой Nitrosomonas sp. значительно уменьшается, а выделение N₂O увеличивается. Обнаружено, что суспензии клеток N.europaea наряду с NO₂- и N₂O образуют NO. С уменьшением концентрации О₂ увеличивался выход обоих газов и росло отношение NO/N₂O, составляя в среднем 1,5 моля NO - N на моль N₂O - N. Следует отметить, что у всех исследованных организмов азот N₂O составлял не более 0,5% от суммы окисленного азота, что более чем на порядок ниже продукции N₂O у Nitrosomonas europaea, наблюдавшейся Иошида и Александером (1970) [4].

Роль нитрификаторов в выветривании горных пород, в повреждении памятников и облицовки сточных каналов позволяет прогнозировать новый период в исследованиях этой группы бактерии.

2.2 Краткая характеристика хемолитотрофных бактерий

Хемолитотрофия - способ существования, обнаруженный только у прокариот, при котором источником энергии служат реакции окисления неорганических соединений.

Существование хемоавтотрофов было открыто С.Н. Виноградским. Началом послужили его работы (1885-1889) по изучению нитчатых микроорганизмов, называемых серобактериями (Beggiatoa) и железобактериями (Leptothrix ochracea). В результате проведенных наблюдений Виноградский пришел к выводу, что жизнедеятельность указанных форм связана с окислением соответственно сероводорода и серы до серной кислоты или закисного железа в окисное и оба процесса имеют энергетическое значение [3].

Свою гипотезу Виноградский блестяще доказал, выделив (1890-1892) чистые культуры нитрифицирующих бактерий (Nitrosomonas и Nitrobacter), которые росли на минеральных средах, окисляя аммонийный азот или нитриты и фиксируя при этом углекислоту [3].

Хемолитотрофы могут существовать как в аэробных, так и анаэробных условиях и использовать довольно широкий круг неорганических соединений в качестве источников энергии. На основании специфичности хемолитотрофов в отношении субстратов их можно разделить на пять основных групп:

• нитрифицирующие бактерии окисляют восстановленные неорганические соединения азота;

• бактерии, окисляющие серу, используют в качестве источника энергии H₂S, молекулярную серу (S₀) или ее частично восстановленные окислы;

• железобактерии окисляют восстановленное железо или марганец;

• водородные бактерии используют в качестве источника энергии молекулярный водород;

• у карбоксидобактерий единственный источник углерода и энергии - СО₂.

К хемолитотрофным можно отнести сульфатвосстаналивающие и метанобразующие бактерии. Сульфатвосстанавливающие бактерии получают энергию окислением в анаэробных условиях молекулярного водорода, используя в качестве конечного акцептора электронов сульфат (SO). Метаногенные бактерии используют CO₂ в качестве конечного акцептора электронов при окислении молекулярного водорода.

Кроме того, к хемоавтотрофам, видимо, принадлежит недавно обнаруженный Н.Н. Ляликовой-Медведевой микроорганизм Stibiobacter, окисляющий окислы трехвалентной сурьмы (Sb₂O₃) до пятивалентной (Sb₂О₅) [11].

Все представители грамотрицательные. Морфологически разнообразны: палочки, кокки, спириллы. Подвижны и неподвижные. Аэробы. Группа разделена на 3 подгруппы в зависимости от химической природы окисляемых неорганических соединений.

Таким образом, выявлены хемоавтотрофы, способные получать энергию в результате окисления минеральных соединений пяти элементов: Н, N, S, Fe и Sb [16].

3 Характеристика бактерий семейства Nitrobacteriaceae

.1 Особенности строения и функционирования

Процесс последовательного окисления аммиака до азотистой и азотной кислот называется нитрификацией, а вызывающие его бактерии - нитрифицирующими. Сущность этого процесса была раскрыта и изучена С.Н. Виноградским [3].

Выделяют две группы нитрозных и нитратных бактерий. Первую группу нитрозных бактерий составляют роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio, вторую - нитратных бактерий - Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus.

Группа нитрифицирующих прокариот представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования. При этом они имеют ряд общих свойств. Все организмы, помещенные в семейство Nitrobacteraceae, не образуют спор, красятся по Грамму отрицательно, облигатные аэробы и не нуждаются в органических факторах роста, оптимум развития лежит при температуре 25-30° и рН 7,5-8,0. Представители различных родов нитрифицирующих бактерий различаются морфологически [27]. Клетки палочковидные, эллипсоидальные, сферические, спиральные и дольчатые клетки без эндоспор. Жгутики субполярные или перитрихальные, часто отсутствуют. Клетки получают энергию от окисления аммиака и нитрита и удовлетворяют свои потребности в углероде путем фиксации CO₂. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии. Не паразитические. Обычно встречаются в почве, пресной воде и морской воде. Клетки богаты цитохромами, но никаких других пигментов обнаружено не было [24].