29. Механизм деления бактерий. Время жизни клетки.

Чаще всего бактерии размнож-ся путём поперечного деления, возникающего в процессе роста.

Наиболее важно воспроизведение нуклеоида, содержащего всю генетич информацию. Нуклеоид прокариотов представлен в виде плотно уложенной спиралью молекулы ДНК. По современным представлениям, ДНК нуклеоида прокариотов явл-ся самореплицирующейся структурой и назыв-ся репликон. Репликонами являются и плазмиды.

Репликация ДНК реализуется ферментами ДНК-полимеразами (бывают 3-х типов). Репликация начин-ся в определённой точке (локусе) ДНК и идёт одновременно в противоположных направлениях. Заканч-ся также в определённом месте ДНК. Затем начин-ся образование межклеточной перегородки. Сначала с обеих сторон клетки врастает 2 слоя ЦПМ. Затем м/у ними синтез-ся пептидогликан и формир-ся перегородка. Этот процесс чувствителен к д-ю антибиотиков. Всё это время клетка растёт. Происходит синтез пептидогликана, ЦПМ, новых рибосом и цитоплазмы. Затем клетки разделяются.

Цепочки клеток образ-ся, когда процесс разделения идёт не до конца.

30-31. Мех-м поступления питательных в-в в клетку. Активный транспорт в-в у бактерий.

Основным компонентом клетки, осуществляющим транспорт питательных в-в и выход из клетки продуктов метаболизма, является ЦПМ.

Питательные в-ва проникают в клетку:

1. путём пассивной диффузии – без энергетических затрат, по градиенту концентрации; так проникают вода, О₂, СО₂, N₂;

2. путём облегчённой диффузии - без энергетических затрат, протекает при участии мембранных белков – транслоказ, пермеаз (например, глицерин у кишечной палочки);

3. путём активного транспорта – с энергетическими затратами, против градиента концентрации, при участии белков (например, глюкоза проникает);

4. путём транслокации химических групп – в процессе переноса происходит химическая модификация питательного в-ва (углеводы фосфорилируются), выход из клетки невозможен.

Выход в-в из клетки:

1. фосфотрансферазная реакция – происходит при фосфорилировании переносимой молекулы;

2. котрансляционная секреция – имеется особая последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через кот-й выходят молекулы белка; так выходят из клетки токсины столбняка, дифтерии;

3. почкование мембраны.

32. Классификация питательных сред.

По составу:

1. синтетические – содержат только химические соединения в установленных дозировках;

2. натуральные – состоят из продуктов животного и растительного происхождения, имеют неопределённый химический состав;

3. простые – пептонная вода, питательный бульон, мясо-пептонный агар, питательный желатин;

4. сложные – на основе простых: сахарный бульон, мясо-пептонный кровяной агар.

Также по составу делят на белковые, безбелковые и минеральные.

По происхождению:

1. искусственные - животные (МПА и МПБ) и растительные (настои сена, соломы, отвары злаков, дрожжей, фруктов, пивное сусло);

2. естественные (природные).

По назначению:

1. универсальные – пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов;

2. специальные:

- элективные (избирательные) – для роста определённого микроорганизма;

- дифференциально-диагностические – например, по отношению микроба к какому-либо субстрату;

- среды обогащения – стимулируется рост одного микроба и угнетается рост другого;

- консервирующие – сохранение патогенных микробов живыми при пересылке в лабораторию.

По консистенции:

1. жидкие;

2. полужидкие – агара 0.2-0.7%;

3. плотные – агара 1.5-2%.

Есть также микро-тест-системы – для обеспечения микрообъёмной технологии биохимической идентификации микробов.

33. Плазмиды.

Это внехромосомные генетические элементы (фрагменты ДНК), в кот-х содержится генетический материал. Находятся в цитоплазме. Обладают св-вами репликона.

Не являются обязательными генетическими структурами. Однако могут передавать довольно важные св-ва клеток:

1. способность к передаче генет. материала донора при конъюгации – F-плазмида;

2. устойчивость к лекарственным препаратам – R-плазмида;

3. синтез бактериоцинов (вызывают гибель бактерий того же или близких видов) – Col-плазмида;

4. синтез токсинов – Ent-плазмида;

5. синтез гемолизинов – Hly-плазмида.

Есть плазмиды, не проявляющиеся фенотипически, - это скрытые (криптические) плазмиды.

Все плазмиды делят на:

1. конъюгативные – переносят собственную ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент при конъюгации;

2. неконъюгативные – не переносят.

При делении клетки плазмиды равномерно распределяются между дочерними клетками. Плазмиды – это факторы, увеличивающие жизнеспособность бактерий в орг-ме хозяина и окружающей среде.

34. Микроаэрофилы.

Микроаэрофилы – нуждаются в О₂ для получения энергии, но лучше растут при повышенном содержании СО₂ (капнофильные). Сюда относятся большинство аэробных бактерий.

35. Причины чувствительности анаэробов к молекулярному о2 воздуха.

При попадании О₂ на среду, в кот-й культивируется облигатный анаэроб, нарушается дыхательная цепь анаэроба. При взаимодействии субстрата с молекулярным О₂ водород соединяется с О₂ и образуется перекись водорода. У аэробов имеется фермент каталаза, кот-я расщепляет перекись водорода. У анаэробов этого фермента нет, что приводит к накоплению перекиси водорода, задержке роста клеток и их гибели.

36. Состав среды Кита-Тароцци.

Это питательная среда для выделения и идентификации анаэробов. Используют как среду накопления. Включает МПБ и кусочки вываренной печени (для связывания свободного О₂).

37. Состав и химизм работы среды Вильсон-Блэра.

Плотная селективная питательная среда для анаэробных бактерий. В составе: сахарный агар + 1% сульфат Na + 0.08% хлорида железа.

Используют для ускоренной диагностики газовой гангрены. При наличии в среде клостридии perfringens через 4-6 часов при t° = 42°С среда чернеет и в ней появляются множественные разрывы агара.

38. Волютин.

Это полифосфат, производное нуклеиновой к-ты. Играет роль запасного питательного в-ва. Относится к включениям. Располагается в цитоплазме.

У дифтерийной палочки определение волютина имеет дифференциально-диагностическое значение: он обладает способностью к метахромазии, то есть окрашивается в другой цвет, чем цвет красителя. Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель и становится жёлтой, а зёрна волютина, фиксировавшие ацетат цинка, - чёрными.

39. Этапы выделения чистой культуры возбудителя.

1. – исходная стационарная фаза, начинается после внесения бактерий в питательную среду. Длит-ть 1-2 часа. Число клеток не растёт.

2. – лаг-фаза (задержка размножения), начинается интенсивный рост клеток, но скорость деления мала. Длит-ть зависит от возраста культуры, биологических особенностей микробов, среды, t°, pH, концентрации CO_2, O₂.

3. – лог-фаза (логарифмическая) – максимальная скорость размножения. Длит-ть несколько часов.

4. – фаза отрицательного ускорения – активность клеток ↓ (из-за истощения питательной среды).

5. – максимальная стационарная фаза – равновесие между кол-вом погибших, вновь образующихся и клеток в покое. Эта фаза стабильна для определённых видов микробов.

6. – фаза логарифмической гибели клеток.

7. и VIII - ↓ скорости отмирания клеток.

40. Как изучают протеолитические св-ва бактерий.

Д-е протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При разложении желатина среда становится жидкой. При разложении казеина (молочного белка) появляется просветление молока и оно приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов образуются индол, сероводород, аммиак, кот-е сдвигают pH в щелочную сторону. Посев проводят на МПБ. Для обнаружения сероводорода в среду помещают фильтровальную бумагу с р-ром ацетата свинца – бумага чернеет. Для выявления индола используют бумагу с р-ром щавелевой к-ты – бумага краснеет. Аммиак – лакмусовая бумага синеет.

41. Как изучают сахаролитические св-ва бактерий.

Эту способность оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот. Используют среды Гисса: пептонная вода, углевод, многоатомные спирты и индикатор. При разложении углевода образуется к-та и индикатор меняет цвет с желтого на красный. Бактерии по-разному ферментируют углеводы, поэтому ряды пробирок приобретают пёстрый вид – набор сред называется «пёстрый ряд».

Газообразование – определяют способность микробов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа. В сосуды со средами вносят стеклянные поплавки, запаянные с одного конца, кот-е всплывают после наполнения их газом.

При разложении молочного сахара (среда Эндо) – цвет колонии меняется соответственно индикатору (красного цвета).

42. Методы культивирования анаэробов.

Облигатными анаэробами называются микроорганизмы, не растущие на поверхности аэрируемой питательной среды. Питательные среды: экстракты и белковые гидролизаты + факторы роста + цельная или лизированная кровь. Для выделения анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, антибиотики, бриллиантовую зелень. Используют среды Кита-Тароцци, Вильсона-Блэра. Посевы в жидких средах заливают вазелиновым маслом. В плотных средах либо заливают тонким слоем агара, либо используют анаэростат (откуда откачивают воздух).

Создают анаэробные условия с помощью следующих методов:

1. физические – кипячение и быстрое охлаждение, высокие пробирки (в глубине происходит рост), вакуумное удаление воздуха с последующей заменой его инертным газом;

2. химические – применение щелочных р-ров, натрия гидросульфита, различных других веществ-редуцентов для связывания остатков О₂;

3. биологические – совместное выращивание анаэробов и аэробов; помещение в питательную среду кусочков печени, мозга, кот-е адсорбируют на себе О₂.

43. Определение подвижности бактерий по Пешкову.

Определение подвижности по Пешкову - при помощи внесения бактерий уколом в столбик полужидкого агара – подвижные растут по всей толще среды, неподвижные – по уколу.

44. Как у бактерий определяют способность выделять индол?

В процессе ферментации пептонов образуются индол, сероводород, аммиак, кот-е сдвигают pH в щелочную сторону. Посев проводят на МПБ. Для выявления индола используют бумагу с

р-ром щавелевой к-ты – бумага краснеет.

45. Как у бактерий определяют способность выделять сероводород?

В процессе ферментации пептонов образуются индол, сероводород, аммиак, кот-е сдвигают pH в щелочную сторону. Посев проводят на МПБ. Для обнаружения сероводорода в среду помещают фильтровальную бумагу с р-ром ацетата свинца – бумага чернеет.

46. Состав среды Эндо, как на ней растут кишечные бактерии?

Содержит агар, лактозу, основной фуксин, Na₂SO₃. Селективно-дифференцировочная среда для кишечной палочки. На среде Эндо лактоза-положительные эшерихии образуют фуксиново-красные колонии с металлическим блеском, лактоза-отрицательные – бледно-розовые или бесцветные с темным центром.

47. Как изучают развёрнутые биохимические св-ва бактерий?

Д-е протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При разложении желатина среда становится жидкой. При разложении казеина (молочного белка) появляется просветление молока и оно приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов образуются индол, сероводород, аммиак, кот-е сдвигают pH в щелочную сторону. Посев проводят на МПБ. Для обнаружения сероводорода в среду помещают фильтровальную бумагу с р-ром ацетата свинца – бумага чернеет. Для выявления индола используют бумагу с р-ром щавелевой к-ты – бумага краснеет. Аммиак – лакмусовая бумага синеет.

Д-е сахаролитических ферментов: эту способность оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот. Используют среды Гисса: пептонная вода, углевод, многоатомные спирты и индикатор. При разложении углевода образуется к-та и индикатор меняет цвет с желтого на красный. Бактерии по-разному ферментируют углеводы, поэтому ряды пробирок приобретают пёстрый вид – набор сред называется «пёстрый ряд».

Газообразование – определяют способность микробов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа. В сосуды со средами вносят стеклянные поплавки, запаянные с одного конца, кот-е всплывают после наполнения их газом.

При разложении молочного сахара (среда Эндо) – цвет колонии меняется соответственно индикатору (красного цвета).

Определение ферментов микробов:

1. плазмокоагулаза – определяют скорость свёртывания микробом плазмы крови;

2. гемотоксин – вызывает лизис эритроцитов на кровяном агаре, вокруг колонии видна зона просветления среды;

3. лецитиназа – разрушает белок яичного желтка, вокруг колоний зона помутнения с радужным венчиком;

4. гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую к-ту в составе соединительной ткани. Утрачивается способность гиалуроновой к-ты образовывать сгусток;

5. фибринолизин – растворяет фибрин плазмы.

48. Какой состав имеют мпа и мпб?

МПА – мясо-пептонный агар: 1 литр мясо-пептонного бульона + 15-25 г мелко нарезанного агар-агара. Кипятить до полного растворения агара. pH = 7.4-7.6. Фильтруют, разливают, стерилизуют 20 мин.

МПБ – мясо-пептонный бульон: мясной настой + 1% пептон + 0.5% NaCl. Смесь кипятить 15-20 мин. pH = 7.2-7.4. Фильтруют, разливают, стерилизуют 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде – 1.2 г/л.

49. Как судят о чистоте выделенной культуры микроорганизма?

Идентифицируют выделенную чистую культуру по комплексу биологических св-в:

1. морфология – размеры и форма колоний, форма краёв колоний, цвет, консистенция (твёрдая или мягкая), запах;

2. культуральные св-ва – микроскопия;

3. биохимические св-ва – смотри 47;

4. антигенные св-ва – ИФА, ПЦР; аллергологические методы;

5. патогенность для животных;

6. чувствительность к антибиотикам.

50. Актиномицеты, морфология, друза.

Это лучистые грибы, патогенны для человека. Строение как у бактерии: клеточная стенка, ЦПМ, в цитоплазме – нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения. В составе пептидогликана есть арабиноза, галактоза, чего нет у бактерий. Иногда есть микрокапсула. Грам+ палочка с характерным ветвлением. Не кислотоупорный. Факультативные анаэробы – для хорошего роста нуждаются в повышенном содержании СО₂. Спор не формирует. Продуцируют антибиотики.

Отличие от грибов: не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, не способны к фотосинтезу, мицелий примитивный, устойчивы к противогрибковым средствам.

Друзы – своеобразные скопления изменённого мицелия в больном орг-ме.

Морфологию актиномицетов изучают в окрашенных мазках и при помощи фазово-контрастной микроскопии. Растут медленно (7-14 суток). На белковых средах колонии прозрачные, бесцветные, гладкие.

51. Плесневые (нитчатые) грибы, родовые морфологические отличия.

Нокардии – относятся к актиномицетам. Грам+. Аэроб. Образует ветвящийся кислотоупорный мицелий. Друз в тканях человека не образует – отличие. От человека не передаётся. Заражение воздушно-пылевым путём и через повреждённую кожу. Идентифицируют при микроскопии клинического материала. Отличительный признак нокардий – высокая чувствительность к рифампицину.

52 И 58. Микроскопическая дифф. Диагностика малярии.