Автореферат: Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода

Иммунофенотип клеток оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (Immunotec, Франция), меченых FITC (HLA-ABC, CD9, CD90, CD106, CD54, CD31, CD117) и PE (CD34, CD54, CD73, CD105, CD62L, CD62P, CD62E), на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали неиммунные меченые FITC и PE моноклональные антитела (Immunotec, Франция) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера.

Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.

Индукцию дифференцировки осуществляли с помощью остеогенных (10-8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 мМ дексаметазона (Sigma, США), 10 мг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания), 200 мМ индометацина (Sigma, США)) дифференцировочных стимулов. Выявление щелочной фосфатазы проводили с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Выявление минерализованных компонентов матрикса проводили, окрашивая культуры клеток ализариновым красным (Sigma, США). Коммитирование ММСК в адипогенном направлении оценивали по появлению клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США).

Концентрацию лактата и глюкозы в среде определяли ферментативным колориметрическим методом, согласно инструкции производителя наборов (Biocon, Германия) на спектрофотометре Eppendorf (Германия) и затем пересчитывали на 1 клетку по формуле:

где [ДMet] величина, на которую изменилась концентрация глюкозы/лактата в среде за 24 часа и Xv среднее количество клеток в данный момент времени. Молярное соотношение продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы (YLa/Glu) рассчитывали как соотношение qLa /qGlu.

Выявление и оценку функционального состояния митохондрий в ММСК проводили с помощью флуоресцентного красителя MitoTracker Red 580 (Invitrogen, США). стромальный клетка кислород митохондрия

Исследование дифференциальной экспрессии генов проводили в ММСК подвергавшихся 96 часовой экспозиции, а также при постоянном культивировании в условиях 20% и 5% содержания О2. Результаты уровня экспрессии генов ММСК, полученные с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США) сотрудниками фирмы ООО «Геноаналитика» анализировали с помощью базы данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” и “Statistica 7.0” для WinXP. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека

Культивируемые ММСК, выделенные из СВФ жировой ткани, представляли собой морфологически гетерогенную популяцию адгезивных клеток, в которой можно выделить треугольные или звездчатые клетки (40-60 мкм), веретеновидные клетки (60-100 мкм) и очень крупные (до 200 мкм) клетки с большим количеством отростков (рис. 1). При субкультивировании ММСК происходила постепенная смена одного типа клеток другим: преобладающие на 1-2 пассаже клетки 1-го и 2-го типа постепенно заменялись клетками 3-го типа, что сопровождалось торможением пролиферации. К 6-му пассажу снова наблюдалось появление клеток 2-го типа и изменение морфологической картины культур ММСК, что вероятно объясняется субселекцией определенной клеточной популяции на данном этапе культивирования. Однако доминирования этого типа клеток не происходило и в последующем в культурах 8-го пассажа снова начинали преобладать крупные распластанные клетки 3-го типа.

Пролиферативный потенциал ММСК характеризовался сходной динамикой показателей пролиферативной активности (число удвоения и время удвоения популяции) вне зависимости от количества ядросодержащих клеток после выделения. Сравнительный анализ числа удвоений и времени удвоения популяции позволил выявить общую тенденцию, которая заключалась в поддержании более высокой скорости пролиферации в течение первых 3-х пассажей и ее значительном снижении, как правило, к 4-му пассажу (табл. 1). Более длительное культивирование сопровождалось сокращением числа удвоений и увеличением доли крупных распластанных клеток 3-го типа и клеток, в которых была выявлена активность в-галактозидазы, свидетельствующей об их старении.

Изучаемые клетки экспрессировали ряд поверхностных антигенов, которые регулируют такие процессы как адгезия, миграция, рецепция, ко-рецепция и межклеточные взаимодействия и формируют характерный иммунофенотипический профиль резидентных ММСК жировой ткани. Иммуноцитохимическое исследование клеток показало стабильную экспрессию ряда поверхностных антигенов, которые в настоящее время широко используются для идентификации ММСК (Gronthos, et al., 2001; Zuk et. al., 2002; Буравкова и др., 2009; Mafi et al., 2011), а именно: HLA-ABC (антиген лимфоцитов человека - A, -B, -C), CD105 (эндоглин, рецептор TGF-в), CD73 (5'-нуклеотидаза), CD90 (рецепторная тирозинкиназа-1), а также CD54 (ICAM-1, молекула межклеточной адгезии 1 типа), CD106 (VICAM-1, молекула адгезии клеток сосудов 1 типа) и CD9 (тетраспанин), при этом клетки не экспрессировали маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток, такие как CD45, СD31, СD34, CD62L, СD62Е, СD62P, CD117(c-kit), HLA-DR (рис. 2).

При оценке дифференцировочного потенциала ММСК была подтверждена их способность коммитироваться в остеогенном и адипогенном направлении в ответ на присутствие соответствующих стимулов в среде культивирования. Наблюдаемый на 1-ом пассаже достаточно высокой уровень активности щелочной фосфатазы (маркера ранней остеодифференцировки) в клетках, не подвергавшихся индукционным стимулам, значительно снижался к 3-му пассажу. При этом клетки в отсутствии стимулов не формировали минерализованного матрикса, тогда как добавление остеогенных индукторов сопровождалось активной кальцификацией соединительно-тканных структур матрикса (рис. 7, а). ММСК также не дифференцировались спонтанно в адипогенном направлении. В ходе индуцированного адипогенеза клетки приобретали близкую к сферической форму, группировались в кластеры клеток, накапливающих в цитоплазме липидные включения различного размера (рис. 7, б).

Таким образом, клетки-предшественники, выделенные из СВФ жировой ткани, характеризовались комплексом морфофункциональных свойств, отражающих их фенотипическую принадлежность к мезенхимальным стромальным клеткам: обладали свойственными этим клеткам морфологическими особенностями и потенциалом к экспансии in vitro, экспрессировали характерные поверхностные маркеры и были способны подвергаться направленной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлении.

Рис. 2. Иммунофенотип ММСК, выделенных из жировой ткани человека. Представлены репрезентативные данные для клеток 4-го пассажа.

Рис. 3. Морфология ММСК 2-го пассажа при экспозиции в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержания кислорода в среде культивирования, фазовый контраст, ув. х 100.

а б в г

Рис. 5. Формирование колоний ММСК 2-го пассажа в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) концентрации кислорода. Окраска кристаллвиолетом, ув. х 0,6.

Влияние пониженного содержания кислорода на морфофункциональные характеристики ММСК

При снижении содержания кислорода популяция крупных клеток 3-го типа уменьшалась, и уже на 2-ом пассаже преобладали клетки 1-го и 2-го типа (рис. 3). Более длительное культивирование в течение 4-х пассажей не вызывало дальнейших морфологических изменений ММСК в условиях 5% О2, тогда как экспансия в условиях 1% и 3% О2 приводила к появлению распластанных клеток с большим количеством отростков.

Клетки с морфологией, отличной от наблюдаемой в стандартных условиях культивирования, имели отличия в уровне экспрессии ряда генов. Было отмечено, что в ММСК при 5% О2 уровень экспрессии генов TUBB3, SVIL и ANK2, продукты которых (в-тубулин, супервиллин, анкерин) участвуют в примембранной перестройке и стабилизации цитоскелета был выше, а генов TPM2, ACTN1, CNN3, CDC42EP3, CDC42EP1, TAGLN, SGCG, продукты которых (тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки Rho-ГТФазы, трансгелин и саркогликан-г) участвуют в формировании адгезионных контактов, взаимодействии с ВКМ и формировании псевдоподий, был ниже, чем в стандартных условиях культивирования (20% О2) (табл. 2). Допуская, что появление клеток 3-го типа связано с их повреждением в процессе культивирования, можно предположить, что приближение концентрации кислорода в среде к тканевому уровню обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества таких клеток, о чем свидетельствует увеличение гомогенности культур ММСК в условиях 5% и 3% О2.

Оценка пролиферативного потенциала культивируемых клеток показала, что уменьшение концентрации кислорода (до 5%-1%) способствовало активации пролиферации (на 2-ом пассаже максимальное количество удвоений в 2 раза превышало значение при 20% О2). При этом более выраженный стабильный прирост клеток наблюдался в условиях 5% О2 (рис. 4, а). Уменьшение концентрации кислорода сокращало время лаг-фазы на кривой пролиферации до нескольких часов, тогда как при 20% О2 лаг-фаза длилась не менее двух дней (рис. 4, б). Экспансия клеток в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась увеличением числа КОЕ-ф, в то время как при 20% О2 формирования колоний не происходило. Перенос клеток в условия пониженного содержания кислорода (5%-1%) активировал эту способность, максимально выраженную на втором пассаже (рис. 5). Механизм влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный потенциал ММСК остается не совсем понятным. Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток может быть уменьшение окислительного повреждения клеток в результате окислительного стресса (Бурнаевский и др., 2010).

Таблица 2. Соотношение уровня дифференциальное экспрессии генов ММСК 2-го пассажа при 5% и 20% О2 . * - достоверное отличие от значений в условиях стандартного содержания кислорода.

Рис. 4. Пролиферативная активность ММСК в условиях различного содержания кислорода. Представлены средние значения числа удвоения популяций (а) и кривые пролиферации ММСК 2-го пассажа (б), культивируемых в условиях 20%, 5%, 3% и 1% О2. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 6.

Рис. 7. Влияние пониженного содержания кислорода на эффективность остеогенеза и адипогенеза ММСК. Гистохимическое выявление компонентов минерализованного матрикса (ализариновый красный) (а) и липидных включений (масляный красный) (б) в культурах ММСК 2-го пассажа и полуколичественный анализ, * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3.

Рис. 8. Потребление глюкозы (белые столбики) и продукция лактата (черные столбики) (а), молярное cоотношение YLa/Glu (б), средняя интенсивность флуоресценции потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red (в) в ММСК 2-го пассажа в предмонослойной культуре, в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3.

Рис. 9. Выявление митохондрий ММСК 2-го пассажа, культивируемых при 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержании кислорода, с помощью потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red.

Рис. 10. Выявление колоний, формируемых при 20% (а,г) и 5% (б,в) содержании кислорода клетками: а - постоянно культивируемыми при 20% О2, б - предкультивируемыми при 20% О2, в - постоянно культивируемыми при 5% О2, г - предкультивируемыми при 5% О2. Окраска кристаллвиолетом, ув. х. 0,6.

Активация пролиферации ММСК в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась более выраженной экспрессией генов семейства Fos (FOSB, FOSL1), продукты которых формируют транскрипционный фактор AP-1, генов PCNA, CCND2, кодирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток и циклин D2, а также гена CKS2, кодирующего регуляторную единицу циклин-зависимой киназы при значительном подавлении экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) (табл. 2). Можно предположить, что увеличение пролиферативной активности ММСК обусловлено активирующимся в этих условиях JNK сигнальным путем, с последующим образованием транскрипционного фактора AP-1, о чем косвенно свидетельствует увеличение экспрессии генов семейства Fos и гена CCND2, кодирующего циклин D2, экспрессия которого происходит под воздействием этого транскипционного фактора. Активация SAPK/JNK и p38 киназных путей при гипоксии была продемонстрирована во многих типах клеток, в том числе ММСК (Scott et al., 1998; Kunz et al., 2003, Lee et al., 2011).