Фактор некроза опухолей существует в форме гомотримера и, соединяясь с TNFR1, индуцирует ассоциацию смертельных доменов рецептора, создавая условия для их взаимодействия с адаптерными протеинами, в роли которых кроме FADD может выступать TRADD [56]. Последний как адаптер способен опосредовать соединение с рецептором таких молекул, как TRAF2 и RIP, что ведет к активации NF-kB и JNK.
TRAF2 и RIP активируют NF-kB-индуцирующую киназу (NIK), которая, в свою очередь, воздействует на особый киназный комплекс, фосфорилирующий ингибитор kB (I-kB). Деградация I-kB делает возможным проникновение NF-kB в ядро и стимуляцию транскрипции генов, отвечающих за синтез интерлейкина-2, -4, -интерферона и других цитокинов [69, 76].
Таким образом, рецепторопосредованный и перфорингранзимовый механизмы могут совместно или независимо друг от друга вызывать апоптоз вирусинфицированных клеток. Предполагается, что это главный способ Т-киллинга при вирусной инфекции [75].
Вирусная стратегия модуляции программы апоптотической гибели клетки
Вмешательство вирусов в танатогенную программу клеток носит разнонаправленный и подчас индивидуальный характер. Так, анализ результатов собственных исследований показал, что у пациентов с длительной персистенцией вирусов клещевого энцефалита, гепатита В и С нарушена реализация апоптоза лимфоцитов крови [9, 19, 25, 27]. Обнаружено, что вирусы гриппа, клещевого энцефалита, а также б-вирусы индуцируют апоптоз в перевиваемых культурах [11, 66, 101]. В работе A.O. Буеверова и соавт. [7] приводятся данные, свидетельствующие о существенно более высоком количестве лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови в состоянии апоптоза у больных хроническими гепатитами В и С.
Рядом авторов показано прямое апоптозиндуцирующее действие вируса гепатита С на гепатоциты [61, 68, 84]. Центральную роль в индукции апоптоза этим вирусом играют его взаимодействия с рецепторными и сигналпередающими системами клетки [61]. С другой стороны, при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барра, отмечено снижение уровня ДНК-фрагментации в лейкоцитах периферической крови [33], что является показателем угнетения способности клеток к апоптотической гибели. Известен феномен защиты от апоптоза клеток, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (HIV), аденовирусами, полиовирусом, вирусом коровьей оспы [13, 49, 111]. Кроме того, HIV обладает способностью защищать от апоптоза инфицированные клетки, одновременно усиливая апоптоз незараженных клеток [13].
Полагают, что перекрестное связывание CD4-рецептора с суперкапсидным гликопротеином HIV-1 gp120 повышает чувствительность Т-клеток к апоптозу. В то же время инфицированные CD4+-лимфоциты менее чувствительны, поскольку вирусный белок Nef обладает антиапоптотической активностью [77]. Многочисленными исследованиями доказана интервенция вирусов на разных этапах программированной гибели клеток [61, 111, 118].
Вирусные белки-регуляторы
В настоящее время процесс апоптоза рассматривается как результат действия конкретной генетической программы, независящей от причины (нормальной или патологической), вызвавшей ее запуск. Об этом свидетельствует не только участие ряда генов в реализации программы гибели клеток, но и открытие специфических генов, контролирующих инициальные этапы апоптоза («гены гибели») и блокирующих апоптозную гибель («гены выживания») [4, 31, 35, 36, 89]. Применение методов индуцированного мутагенеза, молекулярного и генетического анализа позволило идентифицировать несколько генов, ответственных за апоптоз на разных его этапах. Среди них гены р53, c-fos, c-myc, c-jun, Fas, bcl-2 и другие, обеспечивающие реализацию или ингибирование программированной гибели клетки [4, 31, 89].
Члены семейства bcl-2 могут быть функционально разделены на индукторы апоптоза (Bad, Bax, Bcl-XS, Bik, Bid, Buk) и на его ингибиторы (Bcl-2, Bcl-XL). Продукты этих генов находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо-и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клетки [48, 51]. Предполагается, что белки семейства bcl-2, локализуясь в наружной мембране митохондрий, регулируют открытие мембранных каналов, через которые осуществляется выброс цитохрома С, протеазы AIF (apoptosis inducing factor). Вышеуказанные факторы способны прямо или опосредованно (например, через активацию «казнящих» каспаз) индуцировать многочисленные изменения, характерные для апоптоза, в том числе деградацию ДНК [65, 100].
Недавними исследованиями установлено, что все герпесвирусы кодируют гомологи Bcl-2, ингибирующие апоптоз. Одним из представителей таких ингибиторов апоптоза является белок KSBcl-2 герпесвируса, ассоциированного с саркомой Капоши, и антиапоптотический белок BHRF-1 вируса Эпштейна-Барра [62].
Уникальным свойством этого вируса является его способность регулировать активность BHRF-1 гомологом Bax, названным BALF, который обладает проапоптической активностью, но, в отличие от клеточного Bax, не может быть преобразован воздействием каспаз [45]. D.J. Roy и соавт. [90] была выявлена повышенная экспрессия гомолога Bcl-2 гена М-11 MHV-68 в селезенке и легких мышей, зараженных мышечным герпесвирусом.
В период персистенции вируса активации М-11 не отмечалось, но его мРНК продолжала присутствовать, что указывает на наличие разных механизмов защиты герпесвирусов от апоптоза в зависимости от степени активности инфекционного процесса. Увеличивает экспрессию Bcl-2 и белок HIV - Nef [77]. Сердцевинный протеин вируса гепатита С способен ингибировать апоптоз через повышение синтеза Bcl-XL [84].
Из представленного материала видно, что вирусные протеины, подобно белкам семейства Bcl-2, обладают разнообразными механизмами регуляции программированной клеточной гибели.
апоптоз иммунокомпетентный клетка персистирующий вирусный
Влияние вирусов на рецепторный путь апоптоза
При изучении уровня готовности иммунокомпетентных клеток периферической крови к апоптозу в исследованиях было обнаружено увеличение абсолютного числа лимфоцитов, несущих CD95-рецептор, при клинически бессимптомной персистенции вируса клещевого энцефалита, а также при хронических гепатитах В и С [9, 27]. M. Tanaka и соавт. [104] установлено, что прямыми агентами, индуцирующими апоптоз, являются антигены вирусов гепатитов B и C, способствующие гиперпродукции лиганда Fas.
При инфекции вирусом гепатита С значительно повышена экспрессия Fas как на гепатоцитах [87], так и HCV-позитивных мононуклеарах периферической крови [87, 107]. В отношении инфекционного процесса, вызванного HIV, имеет место повышение количества Fas-рецепторов на всех CD4+-клетках независимо от репликации в них вируса [83]. Аденовирус способен индуцировать экспрессию Fas опосредованно через p14(ARF)-экспрессию [63]. Другие вирусы, напротив, снижают экспрессию рецепторов смерти. Так, например, клетки, инфицированные in vitro вакцинным штаммом WR-вируса (western reserve virus), резистентны к Fas-апоптозу из-за низкого уровня экспрессии Fas-рецепторов, что позволяет им избегать цитолитической активности Т-лимфоцитов [55]. Вирусный FLICE-белок, кодируемый несколькими герпесвирусами, уменьшая распад прокаспазы-8 на активные субъединицы, способен предотвращать Fas-индуцированный апоптоз, не допуская таким образом активацию последующих сигнальных путей [44].
Экспрессия Fas-лиганда на поверхности мембраны во многом определяет способность клетки избегать киллерные воздействия со стороны активированных лимфоцитов (как это происходит в иммуннопривилегированных зонах), что, несомненно, является выгодным для внутриклеточного агента. Доказана роль белка Tat HIV в повышении экспрессии FasL на инфицированной клетке. Известно, что Tat оказывает действие на FasL-промотор опосредованно через связь с транскрипционными факторами семейства Egr (Early grouth factors) [115]. В соответствии с последними данными, белок HBx вируса гепатита В, связываясь с белками Egr-2 и Egr-3, также способен стимулировать экспрессию гена FasL [118].
Влияя на гены-промоторы рецепторов смерти и их лигандов, многие вирусы могут индуцировать синтез мутантных (растворимых) форм этих белков. Так, показано достоверное увеличение содержания как растворимой формы Fas-рецептора (sFas), так и растворимого Fas-лиганда (sFasL) в сыворотке крови больных гепатитами В и С [16, 17], а также уровня sFas при хронических вирусных гепатитах в стадии осложнений (гепатоцеллюлярная карцинома) [60].
Определена прямая корреляция уровня сывороточного sFas с активностью вирусного гепатита С [68]. Заслуживает внимания тот факт, что растворимые формы как рецептора Fas, так и его лиганда проявляют апоптоз-супрессивную активность, что в случае sFas выраженно образованием прочных связей с Fas-лигандом, презентированным на иммунокомпетентных клетках, и блокированием его активности, а в отношении sFasL - конкуренцией менее активного мутантного продукта с полноценным лигандом за связывание с рецептором [102].
Передача сигнала смерти в любом случае опосредуется адаптерными молекулами, поэтому еще одним механизмом интервенции вируса в механизмы рецепторзависимого апоптоза является влияние непосредственно на адаптерные протеины и на передачу сигнала от рецепторов к каспазам. Так, взаимодействие сердцевинного белка вируса гепатита С (HCV) с эффекторным смертельным доменом FADD усиливает апоптотический сигнал, а связывание с TRADD разрушает комплекс TNF-TNFR1, не влияя при этом на активацию NF-kb [121]. Особо следует выделить так называемые v-FLIP (virus FLICE-inhibitoty protein), обнаруженные в клетках при инфекции герпесвирусами и поксвирусами. По мнению одних авторов, v-FLIP, связываясь с FADD и FLICE, эффективно ингибируют передачу апоптотического сигнала от всех рецепторов семейства TNF [108]. Другие авторы считают, что v-FLIP нарушают протеолиз прокаспазы-8 на активные р10-и р18-субъединицы во время Fas-индуцированной клеточной смерти [44].
Таким образом, реализация рецепторопосредованного апоптоза в условиях хронизации вирусной инфекции может быть нарушена, что способствует нарушению эффективного клиренса инфектогена.
Взаимодействие вирусов и транскрипционных факторов клетки
Программа апоптоза может быть реализована вследствие возникновения источника сигнала внутри самой клетки [6]. Примером тому является накопление нерепарированных разрывов ДНК в результате нарушения процессов репарации [4, 30]. В лаборатории молекулярной медицины СибГМУ были получены данные, подтвердившие факт повреждения клеточного генома при вирусных инфекциях. У больных хроническими гепатитами В и С, а также клещевым энцефалитом выявлялся повышенный уровень хромосомных аберраций и низкая активность эксцизионной системы репарации ДНК [19, 20, 25-28].
В индукции программы гибели клеток с нерепарируемыми повреждениями генома важная роль принадлежит белку р53. Этот белок с молекулярной массой, равной 53 кДа, локализован в ядре клетки и является одним из транскрипционных факторов, повышенная экспрессия которого приводит к репрессии ряда генов, регулирующих транскрипцию и причастных к задержке клеточного цикла [5]. Переход на путь апоптоза под влиянием р53 осуществляется на уровне транскрипции гена Bax - представителя семейства Bcl-2. В результате происходит сдвиг равновесия димеров от гетеродимеров Bax/Bcl-2 к гомодимерам Bax/Bax [31]. Кроме того, р53 повышает экспрессию генов PIG, продукты которых вызывают окислительный стресс и, как следствие, нарушение проницаемости митохондриальной мембраны [14, 36, 89].
С изменением активности р53 связана модуляция апоптоза при вирусных гепатитах. При интеграции в клеточный геном вируса гепатита В его ген HВх может формировать комплекс с р53, ингибируя таким образом его экспрессию [41]. Кроме этого, предполагается, что НВх-протеин оказывает мутационную инактивацию р53 в клеточных линиях CCL-B печени человека. Показано, что трансверсия (от AGG к AGT) в кодоне экзона 249 гена р53 проявлялась в 504 случаях у больных с гепатоцеллюлярной карциномой при хронической HBV-инфекции [98]. Белок HBx также повышает экспрессию Bax в гепатоцитах и лимфоцитах, что способствует усилению чувствительности этих клеток к апоптогенным стимулам [50].
Установлено, что продукт HIV белок Tat способен ингибировать апоптоз, снижая уровень экспрессии р53 и повышая его для Bcl-2 [64, 67]. Герпесвирусы также продуцируют антиапоптический белок LANA (latency associated nuclear antigen), который взаимодействует с геном р53 и подавляет его транскрипционную активность [52].
Ответственным за нарушение генетического контроля клеточного цикла может стать интеграция вирусного генома в геном клетки-мишени [2, 32]. Подобными свойствами обладают ДНК-содержащие и ретровирусы [10]. Интеграция гена HBx вируса гепатита В в клеточный геном вызывает резкое повышение экспрессии мРНК и белка циклина А в клетках гепатоцеллюлярной карциномы, что является одним из пусковых моментов вирусиндуцированного канцерогенеза [120].
Эффект белка HBx на прохождение клеткой точки рестрикции клеточного цикла (G1/S) опосредуется через его взаимодействие с ингибитором серин-треониновой киназы Cdk (сyclin-dependent kinase) р21. В присутствии р53 HBx активирует транскрипцию р21, что ведет к задержке клетки в фазе G1 и угнетает транскрипцию р21, если белок р53 отсутствует или находится в низких концентрациях [40, 82]. Зависимость эффекта вирусных белков от запрограммированной реакции макроорганизма частично объясняет различия в клиническом течении заболевания у HBV-инфицированных пациентов. Белок HBx активирует ингибитор циклинзависимых киназ р21 в клетках гепатомы Hep3B с нефункционирующим р53, инигибирует циклин Е/Cdk2-зависимое фосфорилирование гистона Н1 [86]. Более того, было показано, что при микст-инфекции HBV+HCV белки HBx и HCV-core совместно угнетают транскрипцию р21. При этом HBx и HCV-core действуют через TGF-в (trasforming growth factor-)-связывающий элемент и репрессию Sp1-сайта на промоторе р21 соответственно. Указанные эффекты усиливали рост и пролиферацию клеток и способствовали развитию гепатоцеллюлярной карциномы [53].