Введение
Актуальность проблемы. Поиск эффективных методов предупреждения и лечения состояний с полиморбидным фоном является одной из важнейших медико-социальных проблем в связи с увеличением продолжительности жизни населения и накоплением в популяции пациентов с сочетанными заболеваниями, взаимоотягощающими течение друг друга [Бессонова Л.О., 2008]. Учитывая общность факторов риска, одним из которых является курение, наличие коморбидной патологии в виде хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и ишемической болезни сердца (ИБС) чаще является правилом, чем исключением. При ХОБЛ создаются условия для возникновения кардиоваскулярных нарушений и для усугубления проявлений коморбидности [Невзорова В.А., 2007; Boudestein L.C.M., 2009]. Среди лидирующих, но нераспознанных при жизни причин смерти у больных ХОБЛ является ИБС. По данным крупных популяционных исследований, риск смерти от сердечно-сосудистой патологии у больных ХОБЛ повышен в 2-3 раза [Huiart L., 2005]. ХОБЛ и ИБС рассматриваются в качестве никотинассоциированных заболеваний, с доказанным взаимоотягощающим течением, в патогенезе развития которых немаловажное значение имеет состояние соединительной ткани, составляющей основу сердечно-сосудистой и дыхательной систем [Suellen M. C., 2006]. Признается актуальным поиск наиболее информативных маркеров риска развития сердечно-сосудистых заболеваний при ХОБЛ, выявление которых на ранних стадиях до развития сердечно-сосудистых катастроф следует относить к вопросам предиктивной диагностики.
Целью исследования является поиск информативных маркеров риска развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией напряжения на основе исследования содержания матриксной металлопротеиназы MMP-9, а также генетических полиморфизмов генов-кандидатов патологии метаболизма соединительной ткани.
Задачи исследования:
1. Определить содержание матрикс-разрушающей металлопротеиназы MMP-9, ее комплекса с тканевым ингибитором TIMP-1, а также соотношение указанных показателей при ХОБЛ и ее сочетании со стабильной стенокардией напряжения.
2. Изучить распределение делеций генов глутатионтрансфераз (GSTs) GSTT1 и GSTM1 при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС.
3. Оценить содержание аллелей G и T гена коллагена I типа COL1A1 при изолированной ХОБЛ и ее ассоциации со стабильной стенокардией напряжения. Охарактеризовать состояние гомозиготных GG и TT, и гетерозиготного GT генотипов гена COL1A1 при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.
4. Выяснить вклад изменения содержания MMP-9, комплекса MMP-9/TIMP-1, делеций генов GSTs, наличия аллелей G и T, генотипов GG, TT, GT гена COL1A1 в риск развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией напряжения.
Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований получены данные, расширяющие представления о патогенетических механизмах развития ХОБЛ и ее комбинации с ИБС. Установлен вклад дисбаланса системы «протеолиз-антипротеолиз» в формирование ХОБЛ и ее комбинации с ИБС. Выявлено, что наиболее выраженные изменения содержания MMP-9 и ее комплекса MMP-9/TIMP-1 зафиксированы при кардиореспираторной патологии. Охарактеризовано распределение аллелей и генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTs и коллагена I типа COL1A1 при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, в том числе в зависимости от стадии ХОБЛ. Определены возможности предиктивной диагностики развития ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, основанной на данных исследования полиморфизма генов GSTs и COL1A1. Установлено, что наличие делеции GSTT1 увеличивает риск развития изолированной ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии. Наличие генотипа ТТ и увеличение доли генотипа GT гена COL1A1 наиболее значимо увеличивает риск развития ХОБЛ.
Практическая значимость работы. Расширены представления о патогенетических аспектах формирования изолированной ХОБЛ и кардиореспираторной патологии. Установлен вклад дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» в развитие ХОБЛ и ее комбинации со стабильной стенокардией напряжения, с наиболее выраженными изменениями в последней группе. Определена значимость оценки генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при ХОБЛ, ассоциацированной с ИБС. Установлена необходимость оценки генотипов гена COL1A1 у пациентов с ХОБЛ. Результаты исследования могут найти применение в практической медицине в программах обследования и лечения ХОБЛ и ее комбинации с ИБС.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Для ХОБЛ и ее комбинации с ИБС характерно возникновение дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» со сдвигом в сторону активации протеолиза и максимальным повышением в сыворотке крови его маркеров - MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 при сочетанной патологии.
2. Среди выявленных полиморфизмов генов глутатионтрансфераз наибольшее значение в риске развития ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии, имеет нулевой генотип GSTT1.
3. Важным фактором формирования соединительнотканного дисметаболизма при ХОБЛ и ее с ИБС является увеличение частоты содержания аллеля T, наличие генотипов TT и GT гена COL1A1. Наиболее высокая частота встречаемости генотипа TT и GT установлена при изолированной ХОБЛ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 5 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Внедрение результатов исследования: Материалы диссертации внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений г. Владивостока и используются в учебном процессе при подготовке интернов, ординаторов и врачей на кафедре терапии, функциональной и ультразвуковой диагностики ФПК и ППС.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях регионального, российского и международного уровней: на ХVIII - ХХI Европейском респираторном конгрессе (Berlin, 2008; Vienna, 2009; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011); VI и VII Дальневосточном регионального конгресса с международным участием (Владивосток, 2009 и 2010); Российском Национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертации изложена на 150 страницах, содержит 14 рисунков и 3 таблицы, состоит из введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 186 источников (33 - отечественных и 153 - зарубежных авторов).
1. Материал и методы исследования
Обследовано 120 пациентов, находившихся на амбулаторном наблюдении в аллерго-респираторном центре и поликлиниках г. Владивостока в течение 2008-2011 гг. Для диагностики ХОБЛ применялись рекомендации международной программы GOLD (Глобальная стратегия диагнос-тики, лечения и профилактики ХОБЛ, пересмотр 2010 г.). Подтверждение или исключение диагноза ИБС у всех обследованных осуществлялось согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов и МКБ-10.
В исследование были включены лица обоего пола с фенотипическими признаками европейской расы. У 60 пациентов установлена изолированная ХОБЛ II-III стадии заболевания стабильного течения (I группа). У 60 пациентов ХОБЛ II-III стадии заболевания в сочетании со стабильной стенокардией напряжения I-II ФК (II группа). Группы обследованных делились на подгруппы в зависимости от стадии ХОБЛ: ХОБЛ II стадии - при 50%<ОФВ1<80% от должных величин, ХОБЛ III стадии - при 30%<ОФВ1<50% от должных величин, ОФВ1/ФЖЕЛ<70%. Соответственно, были выделены следующие подгруппы: IА - ХОБЛ II стадии (n=30); IВ - ХОБЛ III стадии (n=30); IIА - ХОБЛ II стадии, ассоциированная с ИБС (n=30); IIВ - ХОБЛ III стадии, ассоциированная с ИБС (n=30). Контрольную группу (n=30) составили условно здоровые добровольцы, соответствующие основной группе по возрасту, полу, этнической принадлежности. Определение содержания ММР-9 и комплекса ММР-9/ТІМР-1 проводилось методом иммуноферментного анализа [Mosman T.R., 1998] с помощью реактивов R&D Diagnostics Inc. (США). Учет результатов проводили с помощью анализатора Multiscan (Финляндия). Количество MMP-9 и MMP-9/TIMP-1 рассчитывали путем построения калибровочной кривой и выражали в нанограммах/мл (нг/мл). ДНК выделяли из лейкоцитов с использованием фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфных локусов проводили методом ПЦР. Амплификацию производили на амплификаторе GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems производства США с использованием наборов реагентов для полиморфных маркеров: G1546T гена COL1A1 и генов GSTs (производства «ГосНИИгенетика» полиморфные маркеры: I/D гена GSTM1, I/D гена GSTT1, G1546T гена COL1A1) в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты амплификации и гидролиза визуализировали на трансиллюминаторе при помощи гель-документирующей системы Bio-Print 1500/20M (Франция). Для генотипов GSTs гомозиготные делеции определялись наличием одного амплификационного фрагмента длиной 350 п.н. Генотипы COL1A1 по мутации G1546T определялись набором фрагментов: ТТ-генотип - 312 п.н.; GT-генотип - 312, 235 и 77 п.н.; GG - 235 и 77 п.н.
Результаты оценены с помощью программы STATISTICA 6.0. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами и контролем оценивали по тесту чІ. Вычисляли относительный риск по формуле: ОР=ахd/bхс, где а - число больных с наличием и b -- с отсутствием признака у больных; с и d - число здоровых соответственно с наличием и отсутствием признака.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, на базе которых проведены биохимические и генетические исследования: руководителю лаборатории химии неинфекционного иммунитета д.х.н., профессору П.А. Лукьянову, старшему научному сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. М.П. Исаевой.
2. Результаты собственных исследований и их обсуждение
MMP-9 является одним из основных протеолитических ферментов, отвечающих за ремоделирование соединительной ткани. Установлено повышение ее уровня с сыворотке как при ХОБЛ, так и при ИБС [Zourdidakis E., 2004; Kim S.E., 2009]. Однако в литературе отсутствуют сведения о содержании MMP-9 при сочетанной патологии. Согласно полученным результатам, при кардиореспираторной патологии содержание MMP-9 достоверно выше, чем в контроле и при изолированной ХОБЛ в 1,9 и в 1,5 раза соответственно (рис.1).
Рис. 1. Содержание MMP-9 в сыворотке крови при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, & - разница между I и II группами достоверна при р<0,05
ген хронический ишемический полиморбидный
Полученные нами данные свидетельствуют о более значимом увеличении содержания MMP-9 именно при сочетании ХОБЛ и ИБС. Исходя из предыдущих исследований, указывающих на изменение уровня ММР-9 в зависимости от стадии ХОБЛ, нам представилось интересным исследовать состояние ММР-9 при различных стадиях ХОБЛ в обеих группах (рис. 2).
Рис. 2. Содержание MMP-9 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, # - разница между подгруппами пациентов IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05
Как следует из представленных данных, концентрация MMP-9 достигает максимальных значений при III стадии ХОБЛ в обеих группах. В то же время при III стадии ХОБЛ содержание ММР-9 выше при сочетанной патологии, чем при изолированной ХОБЛ (299,84±26,24, 445,17±43,32 нг/мл, соответственно, р<0,001). Повышение содержания MMP-9 по мере увеличения стадии ХОБЛ может быть связано с глубокими процессами ремоделирования легочной ткани при более тяжелых стадиях заболевания, что отмечено и в предыдущих исследованиях [Huiart L., 2005]. Увеличение содержания MMP-9 может быть рассмотрено в качестве индикатора более тяжелого течения ХОБЛ и одновременно быть связанным с риском развития ИБС. Для характеристики протеолитической активности используют не только концентрацию ММР-9, но и ее комплекс с ингибитором TIMP-1. В нашем исследовании содержание комплекса MMP-9/TIMP-1 имеет сходную динамику с ММР-9 (рис. 3).
Рис. 3. Содержание MMP-9/TIMP-1 в сыворотке крови при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, & - разница между I и II группами достоверна при р<0,05
Уровень комплекса повышен в обеих группах по сравнению с контролем (11,44±0,72; 6,41±0,57; 3,15±0,3 нг/мл, соответственно; p<0,001, p<0,001). Установлена достоверная разница между содержанием комплекса при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС в сторону увеличения в последнем случае (6,41±0,57; 11,44±0,72 нг/мл; p<0,001, соответственно). Концентрация комплекса MMP-9/TIMP-1, также как и содержание свободной ММР-9, зависит как от стадии ХОБЛ, так и от наличия или отсутствия ИБС (рис. 4).
Рис. 4. Содержание MMP-9/TIMP-1 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, # - разница между подгруппами пациентов IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05
В обеих группах содержание MMP-9/TIMP-1 достоверно выше при III стадии ХОБЛ. Полученные данные о содержании MMP-9/TIMP-1 согласуются с результатами исследования свободной MMP-9 и указывают на наличие дисметаболизма соединительной ткани в сторону активации процессов протеолиза при стабильном течении ХОБЛ и при сочетании ХОБЛ и ИБС.
Помимо изучения процессов протеолиза нам представилось интересным оценить антипротеазную активность сыворотки, рассчитав соотношение содержания свободной MMP-9 к комплексу MMP-9/TIMP-1 (соотношение «M:К»). Результаты исследования соотношения «M:К» в группе пациентов представлены на рисунке 5.
Рис. 5. Соотношение концентрации MMP-9 и MMP-9/TIMP-1при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, & - разница между I и II группами достоверна при р<0,01
Соотношение «M:К» имеет противоположную тенденцию относительно содержания MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1. Так в контроле показатель «M:К» максимальный и составляет 63,61±5,69. В группе изолированной ХОБЛ показатели «M:К» меньше, чем в контроле. Наиболее низкие значения соотношения «M:К» установлены при сочетании ХОБЛ и ИБС. Если расценивать «M:К» в качестве косвенного показателя, отражающего состояние антипротеазной активности сыворотки крови, то следует предположить, что антипротеазная активность максимальна в контроле и снижена у пациентов ХОБЛ и, особенно, при ее сочетании с ИБС. Анализ соотношения «M:К» в зависимости от стадии ХОБЛ показал, что наименьшее значение «M:К» установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах обследованных (рис. 6). Итак, при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС происходит сдвиг в сторону активации протеолиза с наибольшими изменениями в группе пациентов с кардиореспираторной патологией. Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, # - разница между подгруппами IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05.