Выделяют следующие структурно-функциональные группы микробицидов: детергенты, или поверхностно-активные вещества (ПАВ); стабилизаторы pH и усилители кислотности; полианионы; дендримеры; полисахарид-связывающие пептиды; ингибиторы репликации ВИЧ. Механизм действия микробицидов на основе детергентов, или ПАВ, сводится к солюбилизации оболочки вируса и разрушению капсидных белков. Известными представителями данного класса микробицидов являются ноноксинол-9 (N-9), до- децилсульфат натрия (натриевая соль лаурил-серной кислоты, sodium dodecyl sulfate (SDS)), и смесь цетил-^бетаина и оксида мирамистина (1,0% C31G; SAVVY) [20].
Данный механизм действия детергентов является неспецифическим, эпителий человека также подвергается разрушению, образуются эрозии и язвы, что приводит к увеличению риска заражения ВИЧ. Фаза II клинических испытаний ноноксино- ла-9 показала увеличение риска инфицирования ВИЧ при использовании препарата более 3 раз в сутки [21]. Фаза III клинических испытаний вагинального геля SAVVY на основе 1,0%-го раствора смеси цетила-бетаина и оксида мирамистина, проводимые в Гане и Нигерии, не показали значительных отличий данного препарата от плацебо, что свидетельствует о низкой анти-ВИЧ-активно- сти [22]. Аналогичные результаты были получены и при тестировании геля на основе додецилсуль- фата натрия, хотя данный продукт позиционировался как потенциальный ингибитор оболочечных (ВИЧ, вирус простого герпеса) и безоболочечных вирусов (вирус папилломы человека, ротавирус, полиовирус) [23]. По этой причине разработка микробицидов на основе детергентов на данный момент прекращена.
Другой группой микробицидов с неспецифическим механизмом действия являются стабилизаторы pH и усилители кислотности. Такие ми- кробициды относятся только к вагинальным, а механизм их действия сводится к поддержанию кислой среды влагалища женщины на уровне pH 4. Все микробициды этой группы являются и спермицидами, так как pH семенной жидкости нейтрализует кислую среду влагалища, способствующей проникновению вируса. Интересно то, что в некоторых районах Африки в племенах женщины использовали лимонный сок, предохраняясь от нежелательной беременности. Лимонная и яблочная кислоты, входящие в состав лимонного сока, обладают вирулицидной активностью, т. е. являются микробицидами. Но, как и ПАВ, данные кислоты обладают эрозивным действием на эпителий влагалища. В начале XXI в. врачами была предпринята попытка использовать лактобактерии как микробициды-стабилизаторы pH влагалища. Лактобактерии достаточно давно используются для лечения различных дисбиозов, но эффект такой терапии остается недолгим, а рост колоний лактобактерий занимает достаточно долгое время. Впоследствии исследования по разработке микробицидов на основе генетически не модифицированных Lactobacillus sp. прекратились.
Современным представителем микробицидов - усилителей собственной защиты эпителия является Buffer Gel. Его активный компонент - карбопол, представляющий собой полимер акриловой кислоты, способной значительно снижать кислотность среды влагалища. Доклинические испытания Buffer Gel, проведенные на макаках с использованием методов вагинальной коль- поскопии и ректального лаважа, показали его эффективность в отношении передачи вируса иммунодефицита обезьян (ВИО, англ. simian immunodeficiency virus (SIV)), и нежелательной беременности без нарушения целостности эпителия влагалища [24]. Клинические исследования, проведенные на женщинах-добровольцах в Индии и Таиланде, подтвердили эффективность действия препарата [25]. В 2009 г. Национальный институт аллергологии и инфекционных болезней США (NIAID) выявил угнетение врожденного иммунитета при многократном использовании Buffer Gel, что приостановило выход данного продукта на фармацевтический рынок.
Группа микробицидов на основе полианионов и дендримеров включает в себя такие вещества, как каррагинаны, полимеры нафталинсульфона- та, сульфат целлюлозы, наноразмерные дендри- меры и гуминовые кислоты. Общим механизмом действия этой группы микробицидов является ингибирование фузии вируса путем связывания поверхностных белков ВИЧ или рецепторов и ко- рецепторов клеток-мишеней.
Одними из первых микробицидов этой группы были каррагинаны - семейство линейных сульфа- тированных полисахаридов. Каррагинаны сходны по своей структуре с гепарансульфатом, который используется многими микроорганизмами в качестве биохимического рецептора для первоначального прикрепления к клеточной мембране. Таким образом, каррагинаны выступают в качестве рецепторов-ловушек для фузии вируса [26]. Однако фаза III клинических испытаний, проведенная на 4 000 женщинах-добровольцах в Южной Африке в 2004-2007 гг., показала отсутствие статистически значимого влияния каррагинанов на половую передачу ВИЧ-инфекции [27].
Другими полианионными микробицидами являются полимеры нафталинсульфоната PIC 024-4 и PRO 2000. Механизм действия PRO 2000 сводится к конкуренции за связывание петли V3 белка ВИЧ gp120 с рецептором клеток-мишеней CD4 [28]. Масштабные клинические испытания вагинального геля PRO 2000, проведенные Microbicides Development Programme (MDP 301) на более чем 9 300 женщинах-добровольцах из ЮАР, Танзании, Уганды и Замбии, показали безопасность препарата, но его эффективность не была доказана.
Большой интерес в создании микробицидов вызывают дендримеры (арборолы) - макромолекулы с древообразной и регулярно ветвящейся структурой. На основе синтезированных дендри- меров австралийской фармацевтической компанией Starpharma был разработан лубрикант Viva Gel. Доклинические испытания указывают на его высокую эффективность 85-100% при блокировании передачи вируса иммунодефицита обезьян (ВИО) у макак. На данный момент Viva Gel проходит III фазу клинических испытаний.
Достаточно перспективными, по мнению авторов, природными дендримероподобными микро- бицидами могут стать гуминовые кислоты [29, 30]. Гуминовые кислоты являются сверхразветвлен- ными полиэлектролитами, которые широко распространены в окружающей среде и представляют органические компоненты почвы, торфа, угля, пелоидов и водных систем. Структура гуминовых кислот представлена сетью полидисперсных ароматических и алифатических структур, высоко замещенных карбоксильными и гидроксильными группами. Гуминовые кислоты являются малотоксичными веществами [31] с антиоксидантной активностью [32]. В связи с наличием нескольких активных центров гуминовые кислоты можно рассматривать как комплексные микробициды. Показано, что синтетические аналоги гуминовых кислот, полученные путем полимеризации гидрохинона (HS-1500, оксигумат), способны ингибировать ВИЧ в клетках МТ-2 [33], при этом полуэффективная концентрация составила 50-300 нг/мл, а полутоксическая концентрация - 600 мкг/мл. Предположительным механизмом действия HS- 1500 является блокирование связывания петли V3 gp120 с CD4 рецептором клеток-мишеней. Исследование G.K. Joone и соавт. показало, что HS-1500 усиливает пролиферативный эффект фитогемагглюти- нина на лимфоциты, полученные из крови ВИЧ-инфицированных пациентов [34]. Аналогичный эффект наблюдался при введении HS-1500 ВИЧ-по- зитивным пациентам в дозе 4 г/сут в течение 2 нед. Наблюдаемая стимуляция пролиферации была связана с повышением продукции интерлейкина (ИЛ) 2 и экспрессией рецепторов ИЛ-2 вместе с уменьшением количества ИЛ-10 под действием HS-1500, что делает гуминовые кислоты потенциальными веществами для разработки многомишеневых микробицидов с анти-ВИЧ-активностью.
Еще одной перспективной группой микробицидов являются полисахарид-связывающие вещества. Особенностью этой группы является то, что ее представители относятся к природным пептидам. Основными представителями этой группы являются циановирин N (CVN), полученный из цианобактерий Nostoc ellipsosporum, и гриффит- син (GRFT), полученный из красных водорослей Griffithsia. Механизм действия микробицидов этой группы - связывание маннозных остатков на поверхности вириона с последующим ингибированием фузии. Эффективность данных белков в отношении ВИЧ-инфекции при ректальном и вагинальном введении была доказана в доклинических исследованиях [35].
Пептидные микробициды перспективны, так как возможно встроить ген, кодирующий данный пептид, в любой микроорганизм. В Национальном институте здоровья США (NIH) ведутся исследования по возможности колонизации влагалища женщин бактериями Lactobacillus jensenii со встроенным геном, продуцирующим белок циано- вирин N. Таким образом, микробицид на основе таких живых бактерий будет иметь несколько механизмов действия: способность связывать ман- нозные остатки на поверхности вириона и восстанавливать нормальную микрофлору влагалища.
Важной группой микробицидов являются композиции на основе ингибиторов репликации ВИЧ. Особенностью этой разнообразной по структуре группы является то, что активные вещества данных микробицидов уже показали свою эффективность в высокоактивной антиретровирусной терапии. Механизм действия сводится к ингибированию обратной транскрипции ВИЧ, в результате чего репликация вируса невозможна.
Одним из представителей ингибиторов репликации ВИЧ является дапивирин - ненуклео-зидный ингибитор обратной транскриптазы. На основе него был создан вагинальный гель, продемонстрировавший на этапе доклинических испытаниях способность предотвращения заражения ВИЧ-инфекцией гуманизированных мышей [36].
Ярким представителем ингибиторов репликации ВИЧ является аналог аденозинмонофосфата - тенофовир (Viread). Как микробицидная композиция тенофовир выпускается в виде 1,0%-го вагинального геля. Тенофовир гель показал эффективность 39% в клинических испытаниях Центра по программе исследований СПИДа в Южной Африке (CAPRISA) в июле 2010 г. [37]. Сейчас проходит III фаза (FACTS-001) клинических испытаний данного препарата на 2 700 женщинах-добровольцах из девяти стран Южной Африки. Перспективны микробициды третьего поколения на основе комбинаций антиретровирусных препаратов: тенофовир / эмтрицитабин в форме вагинальных таблеток (закончена I фаза клинических испытаний CONRAD) и маравирок / дапивирин в форме вагинальных колец (закончена I фаза клинических испытаний Microbicides Trials Network).
Помимо природных пептидов были созданы синтетические аналоги хемокинового корецепто- ра CCR5. Одним из таких препаратов является PSC-RANTES, показавший в доклинических испытаниях способность ингибирования химерного вируса SHIVsF162-p3 у макак при вагинальном заражении [38]. Дальнейшее развитие фармакологии микробицидов характеризуется созданием их наноразмерных форм [39] и политаргетных микробицидов, способных предотвращать заражение от нескольких вирусных заболеваний, передающихся половым путем, включая ВИЧ-инфекцию.
микробицид топический иммунопрофилактика
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ КАНДИДАТНЫХ МИКРОБИЦИДОВ
На начало 2018 г. около 80 препаратов проходят стадию доклинических испытаний и около 10 микробицидов находятся на разных фазах клинических испытаний. Большинство микроби- цидов, находящихся в доклинических испытаниях, - это пептиды и белки природного происхождения, ингибиторы на основе антител, т. е. препараты четвертого поколения. Следует ожидать в ближайшее время выход на фармацевтический рынок микробицидов третьего поколения на основе ингибиторов обратной транскриптазы, для которых закончена III фаза клинических испытаний. Препараты же четвертого поколения могут появиться на фармацевтическом рынке не ранее, чем через 15-20 лет, так как средняя продолжительность доклинических испытаний одного лекарственного препарата составляет 10-15 лет, а клинических испытаний - приблизительно 10 лет. Отсутствуют и четкие критерии перехода кандидатных микробицидов на уровень клинических испытаний.
В США, где активно ведется поиск новых ан- ти-ВИЧ-агентов, Управлением контроля качества продуктов и лекарств (U.S. Food and Drug Administration (FDA)) установлены следующие критерии к доклиническим испытаниям микроби- цидов:
1. Десятидневный тест вагинальной ирритации на кроликах.
2. Определение времени системной циркуляции препарата (установление фармакокинетики и фармакодинамики препарата).
3. Общие токсикологические исследования.
4. Генетические и специфические токсикологические исследования.
5. Прочие фармакологические исследования.
6. Определение воздействия на репродуктивную систему.
7. Исследование канцерогенных свойств.
8. Аллергологические исследования (определение гиперчувствительности и фотосенсибилизации).
9. Исследование тестируемого микробицида на способность нарушать целостность презерватива.
В Российской Федерации официально ни один препарат еще не начал прохождение стадии доклинических испытаний. Это связано с тем, что до сих пор не разработаны требования к исследованиям микробицидов и в нормативных документах термин «микробицид» отсутствует. Для отечественной фармакологии очень важным является разработка и утверждение экспериментальной модели трансмиссии ВИЧ-инфекции in vitro, которая бы отображала процессы, происходящие in vivo, а также создание алгоритма скрининга микробицидных препаратов. Это позволило бы начать доклинические испытания отечественных микробицидов и запустило бы процесс по их активной разработке. Экспериментальные модели для оценки эффективности микробицидных препаратов можно разделить на три группы: животные модели, тканевые экспланты и клеточные модели.
Экспериментальные модели тестирования микробицидов на животных очень сложны в исполнении по причине того, что ВИЧ поражает человека и лишь некоторые виды обезьян. Моделирование инфекции на макаках Macaca fasicularis возможно с помощью ВИО или с помощью химерных вирусов SIV/HIV-1 [40]. Анатомия и физиология половых органов обезьян и людей схожи, но данная модель является высокобюджетной и не применима для рутинной практики тестирования кандидатных микробицидов. Учеными в США была разработана модель вагинальной ирритации на кроликах [41], позволяющая посмотреть действие препарата на стенки влагалища и оценить нарушения эпителиального слоя. Но данная модель требует проведения дополнительных тестов для оценки анти-ВИЧ-активности.
Современные методы позволяют тестировать анти-ВИЧ-активность на гуманизированных мышах линии BLT, с пересаженными от человека тканями красного костного мозга, печени и тимуса [42]. Мышиная модель достаточно точно повторяет человеческий патоген-специфический клеточный иммунный ответ, динамику выработки ВИЧ-1-специфичных CD8+ T-клеток во время острой фазы инфекции, а высокая скорость и воспроизводимость эволюции вирусного генома отражают процессы адаптации ВИЧ-1 к иммунному прессингу. Такая модель оптимальна для тестирования и открывает большие перспективы для изучения кандидатных микробицидов благодаря быстрому воспроизводству животных. Но требования к условиям содержания гуманизированных мышей остаются очень высокими.