Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

Приготовленный таким образом тройной препарат-мазок подсуши­вают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают как один мазок, чтобы соблюсти одинаковые условия. Лишь при правиль­ной окраске контролей (темно-фиолетовый стафилококк и розовая кишечная палочка) можно считать правильной и окраску среднего мазка, то есть изучаемой культуры.

Из трёх культур приготовить на одном стекле мазки, зафиксировать и окрасить по Граму, промикроскопировать под иммерсией и зарисовать.

4. Окраска зерен волютина

4.1. по Нейссеру:

Фиксированный мазок окрашивают заранее приготовленной уксуснокислой синькой Нейссера 5 мин. Промывают препарат водой и обра­батывают его раствором Люголя в течение I минуты. Не промывая водой, докрашивают препарат везувином 15 сек. Затем промывают, высу­шивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а тело бактерий - в соломенно-желтый цвет.

4.2. по Лёффлеру:

Фиксированный мазок окрашивают щелочным р-ром метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин., после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Цитоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна – в темно-синий или фиолетовый.

5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.

На предметное стекло нанести каплю туши, внести в нее неболь­шое количество исследуемой культуры с помощью бактериальной петли, тщательно перемешать. Ребром второго предметного стекла сделать мазок, как для исследования крови. Высушить мазок на воздухе и зафиксировать на пламени спиртовки. Нанести на мазок несколько капель водного фуксина на 2-3 минуты, затем промыть, высушить и промикроскопировать. На фоне туши четко видны окрашенные фуксином бактериальные клетки, окруженные светлым овалом (капсулы). Зарисовать препарат.

6. В препарате "раздавленная капля" споры, обладающие более высоким коэффициентом преломления, выглядят в виде блестящих или темных (в зависимости от фокусировки объектива) образований, отличающихся от более тусклых и неясно очерченных тел бактерий.

При окраске фуксином Пфейффера споры не окрашены и выглядят в виде бесцветных овальных образований, расположенных внутри окрашенных клеток или свободно лежащих между клетками.

Для окраски препарата по способу Клейна фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на бумагу налива­ют карболовый фуксин Циля и подогревают препарат над спиртовкой до появления паров 4-5 раз. Пинцетом снимают бумажку и обесцвечивают препарат, погружая его в стаканчик с 1% -ным раствором серной кислоты на 5-6 сек. Тщательно промывают препарат и дополни­тельно докрашивают метиленовым синим 3-5 мин. Промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий. Препараты зарисовать.

7. Демонстрация электронограмм ультратонких срезов различных видов бактерии. Определить на электронограммах клеточную стен­ку, цитоплазматическую мембрану, мезосомы, рибосомы и нуклеоид (ядерную вакуоль).

Контрольные вопросы

Какие красители - кислые или основные - чаще применяются при окрашивании бактерий и почему?

Какие основные красители красного, синего, фиолетового и ко­ричневого цвета применяются в микробиологии?

Как готовится концентрированный карболовый раствор основного фуксина и насыщенный раствор метиленового синего?

Какие способы окрашивания микробов Вы знаете?

Из каких последовательных этапов складывается приготовление препарата-мазка?

Для чего необходима фиксация препарата-мазка?

Какие способы фиксации препаратов Вы знаете?

Как производится фиксация на пламени и как контролируется ее качество?

Как определить, на какой стороне стекла находится мазок?

В чем заключается принцип окраски по Граму?

В какой цвет окрашены грамположительные бактерии и почему?

Какова методика окраски по Граму?

Как контролируется правильность окраски по Граму?

Почему зерна волютина окрашенные метиленовым синим, получили название метахроматических?

Какие образования составляют оболочку бактерий?

Что представляют собой цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка и капсула?

Какие включения могут быть в цитоплазме бактерий?

Какую роль играют капсулы у патогенных бактерий?

По каким признакам можно заподозрить наличие капсул в микроб­ной культуре?

Что такое споры бактерий, каковы их свойства?

Как можно заподозрить наличие опор в микробной культуре?

Каковы принципы окраски капсул у бактерии?

Каковы принципы окрашивания спор у бактерий?

С чем связана высокая терморезистентность спор?

Какова структура пептидогликана?

Каковы функции клеточной стенки бактерий?

Каковы функции цитоплазматической мембраны?

Что такое рибосомы?

Чем отличается ядерный аппарат бактерий от ядерного аппарата эукариотов?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 3.

Карболовый фуксин Циля

Основной фуксин 1 г

Спирт 96^° 10 мл

Карболовая кислота кристаллическая 5 г Глицерин несколько капель

Вода дистиллированная до 100 мл

Водный фуксин (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля 1 мл

Дистиллированная вода 10 мл

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего

Метиленовый синий 10 г

Спирт 96^° до 100 мл

Водно-спиртовый раствор метиленового синего

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего 10 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Метиленовый щелочной синий Лёффлера

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего 30 мл

Едкий натр или едкое кали 1%-ный раствор I мл

Дистиллированная вода до 100 мл

З А Н Я Т И Е 4

Дата ______________

Тема: Физиология бактерий. Питательные среды. Методы стерилизации и дезинфекции. Влияние на микробы физических и химических факторов. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний Выделение чистых культур бактерий: аэробов и анаэробов (1 день).

План занятия:

1. Питательные среды, применяемые для выращивания бактерий.

2. Знакомство с термостатами, их устройством, терморегуляцией. Знакомство с бактериологической посудой.

3. Методы стерилизации. Знакомство с устройством и работой сухожарового аппарата и автоклава.

4. Знакомство с характером роста бактерий на плотных и жидких питательных средах (культуры бактерий на МПА в чашках Петри и в пробирках, а также на МПБ).

5. Пигменты бактерий, демонстрация пигментных культур.

6. Изучение колоний бактерий на пластинках МПА.

7. Техника пересева бактериальных культур с пластинок МПА на косячок МПА, с косячков МПА на косячок и пластинки МПА с помощью бактериальной петли и шпателя.

8. Исследование смеси бактерий. Бактериоскопия смеси и посев ее на пластинки МПА для выделения изолированных колоний.

Методические указания

1. Питательные среды (ПС). По назначению делятся на: Универсальные среды – (мясопептонный агар - МПА, мясопептонный бульон - МПБ) – растут многие вида бактерий. Специальные среды – (кровяные, сахарные, сывороточные) – для культивирования бактерий, плохо растущих или не растущих на универсальных средах. Избирательные ( элективные) среды – (желчь, желчный бульон, пептонная вода, солевой агар) – хорошо растут (избирательно) лишь нужные виды бактерий, рост сопутствующих подавлен. Дифференциально-диагностические среда – (Эндо, Левина, Плоскирева и др.) – различные виды бактерий растут в виде окрашенных или неокрашенных колоний (дифференциация по внешнему виду колоний).

ПС по консистенции: жидкие, полужидкие, плотные (твёрдые).

ПС должны обязательно отвечать следующим требованиям: 1) они должны содержать все необходимые питательные вещества, витамины и соли; 2) иметь оптимальную рН; 3) обладать буферной ёмкостью; 4) иметь дос­таточную влажность (особенно плотные среды); 5) должны быть стерильными; 6) должны быть прозрачными (особенно жидкие ПС).

2. Демонстрация термостатов, бактериологической посуды.

3. Демонстрация сухожарового шкафа, автоклава. Разбор методов стерилизации и дезинфекции.

4-6. Обратить внимание на внешний вид культуры: муть, плен­ка, осадок (для жидких культур). Описать внешний вид колоний на пластинках МПА: размеры; края колонии (ровные, фестончатые, лопастные); поверхность колонии (влажная или сухая, гладкая или шероховатая, складчатая или ровная, плоская или выпуклая и т.д.); прозрачность колонии (прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная); на­личие пигмента и цвет его; консистенция колонии (плотная, рыхлая, слизистая).

Из описанной колонии приготовить препарат-мазок, окрасить фуксином Пфейффера, зарисовать препарат и записать морфологию бактерий, а затем при помощи бактериальной петли сделать посев на косячок МПА. Для этого необходимо простерилизовать петлю, приподнять крышку чашки Петри и стерильной холодной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берется пробирка с косячком МПА (между большим и указательным пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирка открывается над пламенем горелки, обжигается ее край, а затем петля вводится в пробирку до дна ее, где имеется небольшое количество конденсационной влаги. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности косячка агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают на пламени спиртовки край пробирки и пробку и закрывают пробирку над пламенем спиртовки. На пробирке восковым карандашом (маркером) надписывают название культуры, дату посева, фамилию и группу студента и ставят посев до следующего занятия в термостат. Результаты работы оформляют в виде протокола по следующей форме.

Протокол исследования колонии.

1. Размер колонии_______________________________________

2. Форма колонии_______________________________________

3. Поверхность колонии_________________________________

4. Края колонии________________________________________

5. Прозрачность колоний_________________________________

6. Пигмент____________________________________________

7. Консистенция________________________________________

8. Форма бактерий______________________________________

9. Взаиморасположение бактерий_________________________

10. Латинское морфологическое название бактерий _________________________

7. Демонстрация техники пересева бактериальных культур с пластинок МПА на косячок МПА, с косячков МПА на косячок и пластинки МПА с помощью бактериальной петли и шпателя.

8. Приготовить из смеси бактерий препарат-мазок, окрасить его по Граму, промикроскопировать и определить, какие виды микробов находятся в смеси. Произвести посев смеси на пластинку МПА в чашке Петри для выделения изолированных колоний.

Для этого чашка Петри делится маркером на две половины. Каждый студент использует для посева одну половину чашки. Пе­ред посевом следует тщательно проверить качество бактериальной петли, которая должна быть полностью замкнута. Прокаленной и остужен­ной петлей захватывают каплю бактериальной взвеси и переносят ее на МПА в один из углов отведенного для посева сектора (несколько отступая от границы сектора и от края чашки). Затем скользящими движениями наносят петлей штрихи по поверхности МПА возможно ближе штрих к штриху, но не наслаивая один штрих на другой так, чтобы использовать всю поверхность чашки, за исключением полоски в 3-4 мм шириной у края чашки и у границы сектора (во избежание слияния посева с соседним). В момент посева необходимо строго соблюдать правила, предупреждающие загрязнение питательной среды микробами воздуха (посев производить под прикрытием крышки или держа чашку в вертикальном положении, не оставлять чашку открытой). Чашки с посевами помещают в термостат до следующего занятия.

Контрольные вопросы

Каким требованиям должны удовлетворять питательные среды для выращивания микробов?

Какие виды питательных сред применяются в бактериологической практике?

Что такое агар, и для какой цели он применяется?

Что такое универсальная питательная среда?

Какие сложные (специальные) среды Вы знаете?

Каково назначение элективных (избирательных) питательных сред?

Каково назначение дифференциально-диагностических сред?

По какому принципу сконструированы дифференциальные среды Эндо, Левина, Плоскирева?

Какова оптимальная температура для выращивания патогенных микробов?

Что такое термофилы, психрофилы, мезофилы?

По какому принципу устроены терморегуляторы?

Что такое стерилизация?

Что такое дезинфекция?

Чем отличается стерилизация от дезинфекции?

Какие методы используют для стерилизации?

Какие предметы лучше подвергать стерилизации сухим жаром?

Что такое дробная стерилизация?

Когда она применяется?

Что такое пастеризация и тиндализация и в каких случаях они применяются?

Как устроен автоклав?

Какой порядок работы с автоклавом?

Какие методы контроля качества стерилизации вам известны?

Какова методика бактериологического контроля эффективности стерилизации?

Что такое стерилизация фильтрованием?

Какие изменения происходят в жидких питательных средах при росте бактерий?

Какие признаки колоний имеют дифференциальное значение?

Какие формы колоний вы знаете?

Какие края бывают у колоний бактерий?

Как определить прозрачность колоний?

Какой характер имеет консистенция колоний у капсульных бактерий?

Какая поверхность может быть у колоний бактерий?

Почему пигмент у одних видов бактерий окрашивает только колонии, а у других - колонии и питательную среду?

Какие правила необходимо соблюдать при пересеве культуры?

Как следует держать бактериологическую петлю при посеве бактерий на пластинки МПА в чашках Петри и при посеве на косячки?

Как следует держать пробирки с культурой бактерий и питательной средой при посеве бактерий?

Какие методы микробиологической диагностики инфекционных болезней вы знаете?

Какова последовательность исследования смеси бактерий?

Для чего необходимо получить рост изолированных колоний?

Какие методы посева используют для получения изолированных колоний?

Как предупредить загрязнение питательных сред бактериями из воздуха?

Как избежать повреждения плотной питательной среды при посе­ве бактериальной петлей?

С какой целью получают чистые культуры?

Почему нельзя работать со смешанными культурами?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 4.

З А Н Я Т И Е 5

Дата ______________

Тема: Питание, дыхание, размножение, метаболизм и ферментные системы бактерий. Бактериологический метод (2 день).

План занятия:

1. Регистрация результата пересева культуры бактерий из колонии, определение её чистоты. Макро- и микроскопия выросшей культуры.

2. Исследование смеси бактерий (продолжение). Макро- и микроскопия колоний, выросших на пластинках МПА. Посев колоний на косяч­ки МПА для получения чистых культур.

3. Изучение биохимической (ферментативной) активности бак­терий. Знакомство со средами "пестрого ряда", принципами их конструирования и характером изменений в результате роста бактерий. Посев бактерий на среды "пестрого ряда" для изучения их сахаролитических и других биохимических свойств.