Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

1. Спирохеты возвратного тифа. Микроскопия готовых препаратов.

2. Бледная спирохета. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из чистой культуры бледной спирохеты или из исследуемого материала – отделяемого твёрдого шанкра.

3. Лептоспиры. Демонстрация препарата из исследуемого материала с импрегнацией серебром.

4. Актиномицеты: а) микроскопия пре­парата-мазка из чистой культуры актиномицета; б) демонстрация готового препарата друзы актиномицета.

5. Нитчатые (плесневые) грибы. Макроскопия культур и микроскопия препара­тов "раздавленная капля".

6. Дрожжевые грибы. Микроскопия окрашенных препаратов-мазков.

7. Дрожжеподобные грибы рода кандида. Микроскопия культур грибов кандида.

8. Простейшие:

а) микроскопия трипаносом, окрашенных по Романовскому;

б) микроскопия препаратов лейшманий из тканей больного и из чистой культуры.

9. Малярийный плазмодий. Микроскопия препаратов из крови больных малярией: изучение стадий развития плазмодия маля­рии.

10. Токсоплазмы. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из органов зараженной токсоплазмами белой мыши.

11. Амебы. Микроскопия готовых препаратов-мазков из испражнений больного амёбиазом.

12. Риккетсии. Разбор морфологии по таблицам.

13. Хламидии. Разбор морфологии по таблицам.

14. Микоплазмы. Разбор морфологии по таблицам.

Методические указания

1. Боррелии возвратного тифа в мазке крови больного при окраске по Романовскому-Гимзе на фоне форменных элементов крови выглядят как извилистые фиолетово-сиреневые нити, образующие от 3 до 8 завитков спирали. Завитки неравномерные, глубокие, шаги между завитками разные.

2. Бледная трепонема – возбудитель сифилиса – имеет вид спирали, напоминающей слегка растянутую пружину, имеющую от 6 до 14 завитков. Амплитуда завитков средняя, равномерная, шаг между завитками одинаковый. На концах пружина растянута, как бы, сильнее. При окраске по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет.

3. Лептоспиры имеют вид тонкой сильной закрученной пружины, имеют 14-22 витка спирали. Концы часто загнуты в виде крючков (завитки второго порядка), что может им придавать С- или S-образную форму.

4. При микроскопии окрашенных мазков из чистой культуры обратить внимание на сплетение тонких нитей (гифов) и их истинное ветвление. Переплетение гифов – мицелий.

В гистологическом срезе из органа при актиномикозе центральная часть друзы актиномицета представляет сплетение тонких нитей, окрашенных в темно-фиолетовый цвет. Отходящие на периферию концевые нити образуют колбовидные вздутия, окрашенные в розовый цвет.

5. В каплю вода на предметном стекле вносят небольшую частицу гриба и накрывают покровным стеклом. При микроскопии со слабой и сильной сухими системами обратить внимание на строение мицелия и органов плодоношения. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла - многоклеточный. Органы плодоношения: большой спорангиеносец с эндоспорами у мукора; конидиеносцы несептированные в виде лейки у аспергилла, септированные в виде кисти рук у пеницилла.

6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.

7. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 мкм. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная.

Наружных спор типа конидий и внутренних типа аскоспор дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды рода Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10-20 мкм, форма округлая, оболочка толстая, двуконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называются псевдомицелием и отличаются от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования.

8. Патогенные простейшие – жгутиконосцы.

8.1. Трипаносомы являются патогенными простейшими, относящимися к типу Sarcomastigophora, имеющими очень характерную морфологию. В мазке крови больного африканской сонной болезнью при окраске по Романовскому-Гимзе имеют размеры 15-30 мкм в длину и 1,4-3,0 мкм в ширину, длина жгутика колеблется от 12 до 42 мкм. Удлиненно-овальное ядро лежит почти в середине клетки, на заднем конце располагается блефаропласт, от которого отходит жгутик. Последний волнообразно изогнут, между ним и телом трипаносомы натянута прозрачная ундулирующая мембрана. От противоположного конца клетки жгутик продолжается на некотором расстоя­нии свободно.

8.2. Лейшманиальная форма (амастигота, тканевая форма) обнаруживается в патологическом материале в сво­бодных макрофагах или клетках системы мононуклеарных фагоцитов. Амастиготы представляют собой мелкие овальные клетки размером 1-3 × 2-6 мкм с располо­женным сбоку овальным ядром и хорошо видимым палочковидной формы кинето-пластом. В просвете кишечника переносчика-москита и в культуре на питательной среде безжгутиковые формы превращаются в подвижные жгутиковые промастиготы (лептомонадная форма). Они имеют веретенообразную вытянутую форму, размеры 4-6 × 10-20 мкм и жгутик, отходящий от кинетопласта. При окра­ске по Романовскому-Гимзе цитоплазма амастиготы и промастиготы окрашивается в голубой или голубовато-фиолетовый цвет, а ядро, кинетопласт и жгутик – в крас­ный или красно-фиолетовый цвет.

9. В препаратах из крови больных трехдневной малярией найти различные стадии развития малярийного плазмодия: молодые шизонты кольцевидной формы с вакуолью в центре; зрелые шизонты неправильной амебовидной формы без вакуоли; делящиеся шизонты - в стадии меруляции; макфо- и микрогаметоциты правильной овальной формы. Обратить внимание на форму и размеры эритроцитов.

10. Токсоплазмы имеют форму полумесяца или напоминают доль­ки апельсина. Один конец токсоплазмы заострен, а другой - закруглен. Размеры их следующие: длина 4-7 микронов, ширина – 2-4 мкм. При окраске по методу Романовского-Гимзе цитоплазма токсоплазм окрашивается в голубой цвет; ядро, имеющее вид скопления гранул и сети, - в рубиново-красный цвет. Ядро располагается, как правило, в центре паразита, занимая около 1/4 части его тела.

11. Основной диагностический признак амёбиаза – обнаружение в испражнениях больного цист. Цисты правильной шаровидной формы, иногда слегка вытянуты, диаметр 8-15 мкм. Хорошо заметна бесцветная оболочка. Зрелые цисты содержат 4 ядра, незрелые цисты имеют од­но, два, три ядра и вакуоль, содержащую гликоген. В свежем препарате ядра едва за­метны; они хорошо выявляются при обработке препарата раствором Люголя.

12. Риккетсии – грамотрицательные прокариоты, не растущие на питательных средах, имеют мелкие размеры, форму палочек, кокковидную, иногда нитевидную. Жизненный цикл риккетсии зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из 2 ста­дий — вегетативной и покоящейся. Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии, имеют палочковидную форму, активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью. Риккетсии покоящейся стадии имеют сферическую форму и не размножа­ются. Обнаруживаются внутриклеточно окраской по Здродовскому.

13. Хлами­дии – грамотрицательные прокариоты, облигатные внутриклеточные «энергетические» паразиты. Основные стадии жизненно­го цикла:

1. элементарные тельца – мелкие (0,2-0,5 мкм) электронно-плотные шаровид­ные структуры, имеющие компактный нуклеоид и ригидную трехслойную клеточ­ную стенку;

2. инициальные (исходные), или ретикулярные, тельца – большие (0,8-1,5 мкм в диаметре) сферические образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой кле­точной стенкой и фибриллярным нуклеоидом;

3. промежуточные тельца — промежуточная стадия между элементарными и ре­тикулярными тельцами.

Вегетативные формы размножаются путем бинарного деления внутриклеточно, но не инфекционны, когда выделяются из клетки-хозяина. Для микроскопического обнару­жения хламидии в инфицированных клетках (тканях) применяют различные спосо­бы окрашивания: Романовского-Гимзы, Кастенады, Маккиавелло и др. При окра­шивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Однако хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при фазовоконтрастной микроскопии влажных препаратов под стеклом.

14. Микоплазмы – мелкие грамотрицательные прокариоты, лишённые клеточной стенки. Морфология их различна – шаровидные, вакуолизированные, нитевидные (нередко ветвящиеся), гранулярные (элементарные тельца) структуры. Обычно непо­движные, но некоторые виды обладают скользящей подвижностью.

Контрольные вопросы

Какое место занимают спирохеты в системе микроорганизмов?

Дайте классификацию спирохет.

Какое строение имеют спирохеты?

Какие метода микроскопии применяются для изучения морфологии спирохет?

Какой принцип микроскопии в темном поле?

Какое место занимают актиномицеты в системе микроорганизмов?

Как устроена друза актиномицета?

Каковы особенности морфологии актиномицетов?

Что такое спорангий, гифы, мицелий, конидии?

Чем отличаются мицелий и органы плодоношения мукоровых, аспергилловых и пеницилловых плесеней?

Чем отличаются споры грибов от спор бактерий?

Каковы строение и способы размножения дрожжей?

Каковы морфологические отличия дрожжеподобных грибов от дрожжей?

Что такое аски?

Почему дрожжеподобные грибы относятся к категории несовершенных грибов?

Какие грибы используются как продуценты антибиотиков?

Какова роль дрожжевых и дрожжеподобных грибов в медицине и промышленности?

Что такое хламидоспоры? Псевдомицелий?

У каких грибов имеет место их образование?

Дайте классификацию простейших.

Назовите патогенных представителей из каждого класса простей­ших.

Какое строение имеют трипаносомы?

Что такое блефаробласт, ундулирующая мембрана?

Какое строение имеют лейшманин?

Чем отличается лептомонадная форма лейшманий от лейшманиальной?

Какова классификация возбудителей малярии?

Какие отличительные признаки имеет комар - переносчик возбудители малярии?

Какие циклы развития имеет малярийный плазмодий?

Как и где протекает спорогония?

Как и где протекает шизогония?

Какова морфологии молодых и зрелых шизонтов, микро- и макро-гаметоцитов и стадии меруляции у возбудителя 3-х дневной малярии?

Каковы отличительные особенности возбудителей 4-дневной и тропической малярии?

Как изменяются эритроциты при различных формах малярии?

Какое строение имеет токсоплазма?

Что такое риккетсии, их морфологические и биологические особенности?

Что такое хламидии, их морфологические и биологические особенности?

Что такое микоплазмы, их морфологические и биологические особенности?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 2.

Для дифференциации малярийных плазмодиев необходимо учитывать следующие признаки:

1. Размеры, форма и количество молодых шизонтов;

2. Размеры и форма зрелого шизонта;

3. Количество мерозоитов на стадии меруляции;

4. Размеры поражённых эритроцитов;

5. Морфология половых клеток - гаметоцитов.

При всех формах малярии молодой шизонт имеет форму "голубого перстня с рубиновым камнем". При тропической малярии в одном эри­троците может быть иногда 2-3 молодых шизонта одновременно, при остальных формах - только один.

При 3-дневной и тропической малярии зрелый шизонт имеет амёбовидную форму с зернистостью, при 4-дневной - лентовидную форму с узким ядром в виде рубиновой полосы сбоку.

На стадии меруляции при 3-дневной малярии в пораженном эритроците 16-20 мерозоитов, при 4-дневной – 6-8, при тропической – до 30.

Пораженный эритроцит увеличен в диаметре в 1,5-2 раза по сравнению с нормальным только при 3-дневной малярии.

Гаметоциты при 3-х и 4-дневной малярии крупные, занимают почти всю площадь эритроцита, у макрогамет ядро крупнее, у микрогамет – мельче. При тропической малярии гаметоциты имеют серповидную форму.

З А Н Я Т И Е 3

Дата ______________

Тема: Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний. Морфология и ультраструктура микроорганизмов.

План занятия:

1. Знакомство с основными анилиновыми красителями и приготов­лением их растворов для окрашивания микроорганизмов.

2. Приготовление препарата-мазка, фиксирование его, окрашивание и микроскопия.

3. Сложные методы окраски микробов. Окраска по Граму с применением контролей и без них.

4. Включения у бактерий. Окраска зерен волютина по Нейссеру и по Лёффлеру.

5. Капсула у бактерий. Окраска капсул в препаратах-мазках из культуры палочки Фридлендера по методу Бурри-Гинса.

6. Споры у бактерий. Исследование спор в неокрашенных препа­ратах (раздавленная капля) и в препаратах-мазках, окрашенных вод­ным фуксином и по Клейну.

7. Изучение клеточных ультраструктур по электронограммам.

Методические указания

1. Анилиновые красители используются при светлопольной микроскопии для окрашивания микроорганизмов, имеющих клеточное строение, для более качественного наблюдения их морфологии и выявления отдельных субклеточных структур.

В микробиологической практике наиболее часто используются следующие анилиновые красители: I) красные (фуксин основной, фуксин кислый, сафранин, нейтральный красный, конгорот); 2) синие (метиленовый и толуидиновый синие и др.); 3) фиолетовые (генциан фиоле­товый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый); 4) желто-коричневые (везувин, хризоидин); 5) зеленые (бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый).

Из перечисленных анилиновых красителей готовят основные насыщенные спиртовые растворы, которые могут храниться длительное время. Для приготовления рабочих растворов основной насыщенный спиртовый раствор красителя разводят дистиллированной водой в соот­ношении 1:10.

2. На чистое предметное стекло нанести каплю воды. Прокаленной и остуженной петлёй захватить очень небольшое количество микробной массы и коснуться ею капли так, чтобы оставить в ней облач­ко помутнения. Прокалить и остудить петлю и, перемешав каплю, раз­мазать ее тонким слоем по стеклу, после чего петлю снова прокалить и поставить в штатив.

Подсушить приготовленный мазок на воздухе. Зафиксировать ма­зок путем проведения нижней стороной через пламя 3-4 раза. Фиксирование считается хорошим, если стекло, приложенное к тыльной поверхности кисти, дает ощущение легкого жжения. При отсутствии та­кого ощущения препарат может смыться, а при ощущении ожога микроскопическая картина будет искажена.

Положить препарат на мостик для окраски мазком вверх и окрасить нужным методом. После окрашивания тщательно промыть препарат водой и обсушить препарат, аккуратно промокая (но не вытирая!) фильтровальной бумагой. Микроскопировать с иммерсионным объективом. Микроскопическую картину зарисовать в тетрадь.

3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной карболовым раствором генцианвиолета, и увлажняют его 2-3 каплями воды. Окрашивание продолжается 2 мин.

Сбросив пинцетом фильтровальную бумагу, на препарат наливают на 2 мин. раствор Люголя. Слив раствор Люголя, не промывая препарат, наливают на него для обесцвечивания несколько капель 96^° спирта на 30 сек (обес­цвечивание должно производиться при покачивании стекла).

Быстро смыв спирт водой, препарат докрашивают раствором фук­сина Пфейффера в течение 1-2 мин., после чего промывают водой и высушивают.

Для окраски по Граму на одном стекле готовятся три мазка из разных культур (для контроля). Мазок в середине стекла готовят из изучаемой культуры, а по концам стекла с одной стороны - из куль­туры стафилококка (заведомо грамположительная); а с другой - из культуры кишечной палочки (заведомо грамотрицательная).