Материал: Методи спектрофотометрії

7. Інфрачервона спектроскопія

В результаті поглинання світла в ІЧ-області (від 103 до 105 нм)(Рис. 14-3) відбуваються переходи між коливальними рівнями основного стану молекули. Коливальні рівні і ІЧ.-спектри виникають за рахунок характеристичних рухів (розтягування зв'язків, зміни величини кутів між зв'язками і більш складних типів рухів) різних функціональних груп (наприклад, метильної, карбонільної, амідної і т. д.). Цінність спектрального аналізу в ІЧ-області обумовлена тим, що вид коливань кожної групи дуже чутливий до змін хімічної структури, конформації і оточення, і в цьому сенсі ІЧ-спектроскопія не відрізняється від спектроскопії у видимому й ультрафіолетовому світлі. Цей метод може застосовуватися для вивчення хімічних груп, які не можна досліджувати з допомогою абсорбційної спектроскопії в ультрафіолетовому і видимому світлі.

.1 Методика вимірювань

Підготовка зразка для аналізу є найбільш важливим моментом при визначеннях в інфрачервоній області спектра. Адже розчинники мають характерне інфрачервоне поглинання, дещо ускладнює методику. Однак тверді речовини, які внаслідок розсіювання світла непридатні для ультрафіолетової і видимої області, широко застосовуються для інфрачервоної спектрофотометрії.

Енергія інфрачервоних фотонів на відміну від ультрафіолетової і видимої енергії незначна і структурні зміни під їх впливом зустрічаються дуже рідко.

Вимірювання поглинання в інфрачервоній області зазвичай проводять з розчинами, суспензіями в парафіновому маслі або з твердими речовинами у вигляді дисперсії з лужними галоідами.

Рідини вносять в прилад у вигляді капілярної плівки між двома пластинками кам'яної солі або в чистому вигляді в кюветі товщиною 1 мм або менше.

Тверді речовини та рідини можуть також вимірюватися в розчинах. Сірковуглець і чотирихлористий вуглець є найбільш придатними речовинами. Ці розчинники також мають свої характерні смуги поглинання, проте, якщо комбінувати різні розчинники, можна отримати спектр речовини по всій його області. З інших розчинників можуть бути рекомендовані хлороформ, тетрахлоретилен, метиленхлорид.

Для зменшення поглинання розчинника воліють використовувати концентровані розчини та кювети від 1 до 0, 05 мм.

Розчинники, окрім хорошої пропускаємості, природно, не повинні взаємодіяти з розчиненою речовиною та з матеріалом, з якого зроблено кювету.

Якщо речовина має низьку температуру плавлення, кілька кристалів поміщають на пластинку солі і нагрівають в шафі. Коли речовина розплавиться, його накривають другою платівкою і, таким чином, отримують тонку плівку речовини. Залежно від температури, при якій підтримується кюветноє відділення приладу, можна отримати спектр речовини в рідкому або твердому стані.

Іноді концентрований розчин речовини в летючому розчиннику, ефір, хлороформ, спирт і т. п. наносять по краплях на платівку кам'яної солі. Після випаровування розчинника на платівці залишається плівка твердої речовини.

Найчастіше готують завись речовини в рідкому парафіні або дисперсію у вигляді дисків (таблеток) в лужному галоида.

Тверді речовини розтирають з невеликою кількістю парафіну (спектроскопічного якості) до отримання гомогенної суміші, яку потім поміщають між пластинками хлориду натрію і проводять вимір. Розсіювання світла при цьому залежить від розміру частинок речовини і відмінності в коефіцієнті заломлення досліджуваного речовини і парафінового масла. Підвищення гостроти і висоти смуг поглинання зростає зі зменшенням розміру частинок. В області вище 7 мкм для частинок розміром 3 мкм впливом цього чинника можна знехтувати. Найбільшому впливу розсіювання світла піддаються сильно виражені смуги поглинання.

Складові компоненти суспензії повинні мати. Близькі зміни коефіцієнта заломлення в інфрачервоній області, інакше близько смуги поглинання може виникнути асиметрична смуга поглинання зі зміщенням.

Недоліком вимірювань в рідкому парафіні є той факт, що поглинання вуглеводнів маскує смуги зв'язків С-Н досліджуваної речовини. Якщо необхідно вивчати специфічно цю область, рекомендують використовувати перфтор-гас або гексахлорбутадієн. Крім того, потрібен певний навик для отримання суспензій з низьким ступенем розсіювання і чіткістю смуг поглинання.

Для отримання дисперсії речовину розтирають з сухим дрібно подрібненим бромідом калію або хлоридом калію (спектроскопічної якості) стосовно до лужного галоіда 1:200. Частина суміші переносять в спеціальну матрицю, піддають дії вакууму (для видалення повітря) і пресують. Отриманий прозорий диск-таблетку поміщають у спеціальний утримувач і проводять вимірювання.

Слід бути обережним при оцінці спектрів твердих речовин, що існують у вигляді декількох кристалічних модифікацій, так як різні кристалічні форми мають різні інфрачервоні спектри. В деяких випадках існує також можливість фізичних або хімічних змін при розтиранні з парафіновим маслом або з лужним галоідом.

Труднощі, пов'язані з поліморфізмом, можуть бути подолані приготуванням розчинів стандарту і випробуваного речовини у відповідному розчиннику. Потім розчинник видаляють випарюванням, готують для кожного залишку нові диски, які потім піддають вторинному дослідженню.

Методика визначень з суспензіями або дисперсіями в лужному галоіда найчастіше використовується для поточного фармацевтичного аналізу.

При вивченні структур, однак, рекомендують проводити вимірювання в розчинах.

Інфрачервоні спектрофотометри реєструють на папері відсоток пропускання або поглинання по відношенню до хвильовому числу або довжині хвилі. Техніка вимірювань практично не відрізняється від подібної в ультрафіолетовій області.

Двопроменеві прилади забезпечують свідчення, вільні від впливу парів води і поглинання вуглекислого газу, і дають можливість компенсації поглинання розчинника при роботі з розчинами.

При диференціальних вимірах можна отримати спектр окремих смуг поглинання, менш помітних при звичайних визначеннях. Для цього основний компонент за аналогією з вимірюваннями в ультрафіолетовій області поміщають в контрольну кювету і в результаті компенсації основних показників спектру отримують спектр окремих вторинних функціональних груп. Методика диференціальних визначень може бути застосована для випробування на чистоту, тому що при компенсації основних компонентів будь-яка домішка за умови, що в контрольній кюветі знаходиться більше очищене речовина, буде помітна на спектрі. Таким чином, можна виявити і кількісно виміряти до 0, 05% домішок.

Той же спосіб можна застосувати для кількісного визначення лікарських форм, з яких важко витягти діючу речовину. Наприклад, при аналізі масляних розчинів, застосовуючи в якості контролю масло, можна отримати і виміряти смугу поглинання, характерну для досліджуваної речовини. Однак цей метод має обмежену цінність для фармакопейного аналізу внаслідок необхідності потрібно мати речовину певної якості для порівняння.

Труднощі, що виникають при диференціальних вимірах, обумовлені тим, що при сильному поглинанні в обох променях (вивчення структурних особливостей) цей метод може бути надзвичайно корисним.

7.2 Інформація, що міститься в інфрачервоних спектрах

По-перше, необхідно відмітити що при зображені ІЧ-спектрів використовується хвильові числа 1/ λ або частоти v, а не довжини хвилі. У термінах частот кожна, лінія в ІЧ-спектрі може бути охарактеризована частотою максимума поглинання (v-макс), шириною лінії на половині висоти v1/2 оптичної щільності ліній, отриманих коли електричний вектор світлової хвилі паралельний і перпендикулярний осі молекули . В результаті численних досліджень мономерів відомої структури тепер точно встановлено, якій групі і якому типу коливання відповідає кожна полоса в спектрі. В випадку простих простих з’єднань ІЧ-спектрів відрізняються від спектрів в видимому і ультрафіолетовому світлі тим, що вони складаються із вузьких ліній .(рис.7-2).Проте в випадку макромолекул настільки велике число типів зв’язків і так багато різних конформацій, що кожна лінія зміщується в тій або іншій степені в залежності від положення відповідної групи в молекулі, так що всі лінії перекриваються і внаслідок цього в спектрі знаходиться декілька відносно широких ліній .

рис.7-2.

8. Виявлення фальсифікації органічних лікарських речовин, випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі. Інфрачервоні спектри поглинання та їх застосування для ідентифікації лікарських речовин

Спектрофотометрія в ультрафіолетовій області є одним з основних загальних методів аналізу лікарських речовин та їх препаратів, включених в будь-яку сучасну фармакопею.

Встановлення залежності між будовою речовин і їх електронними спектрами є складною проблемою, розгляд якої знаходиться поза межами даної роботи. Слід, однак, зупинитися на деяких закономірностях, що визначають характер спектрів.

Поглинання в ультрафіолетовій і видимій частинах спектра зазвичай пов'язують з наявністю в молекулі речовини певних груп - хромофорів. До них відносяться подвійні і потрійні вуглецеві зв'язки, карбонильна, карбоксильна, азо-, нітро-та інші групи. Відомо також, що деякі групи, не будучи хромофорною, збільшують інтенсивність забарвлення речовини - такі групи називають ауксохромними, або ауксохромами. Типовими прикладами ауксохромів можуть бути гідроксильна та аміногрупи.

Вплив різних замісників на характер поглинання зручно спостерігати при розгляді спектрів простих молекул. Інтерпретація спектрів органічних речовин, що мають складну будову, утруднена через присутність в молекулі більш ніж однієї хромофорної і ауксохромної групи. Часто певні групи хромофорів проявляються спектрально як єдиний комплекс. Так, наприклад, структура бензолу має характерні смуги поглинання при 200 і при 255 нм.

Якщо введення нової групи в молекулу речовини не зачіпає наявні хромофорної структури, то не станеться якоїсь значної зміни спектра. Тому ряд фармакопейних речовин (фенамін, ефедрин і лідол) мають типову смугу поглинання бензолу при 257 нм.

При введенні в бензольне ядро фенольної групи смуга поглинання зміщується до області 280 нм, де особливо зростає вплив розчинника, тому що є можливість утворення ауксохрома у вигляді - ВІН (кисла і нейтральне середовище) або О-(лужне середовище). Типовими прикладами одноатомних фенолів є морфін і естрадіол, і двоатомних фенолів - адреналін і ізопреналін.

Інтенсивне поглинання багатьох кетостероїдів повністю залежить від пов'язаною системи Золото А. Інші групи в молекулі не роблять впливу на характер спектра. Тому ряд стероїдів (преднізон, преднізолон, прогестерон, дезоксикортикостерону, гідрокортизон, кортизон і метилтестостерон) має подібний спектр з максимумом близько 240 ім.

Похідні барбітурової кислоти проявляють максимум при рН 7 внаслідок виникнення хромофорної групи:

Для ідентифікації невідомої речовини в органічній аналітичній хімії спектр досліджуваної речовини зазвичай порівнюють з отриманим при тих же умовах спектром речовини, будова якого відома.

Встановлення автентичності речовини по ультрафіолетового спектру є цінним доповненням до хімічних і фізико-хімічних методів фармакопейного аналізу. Далі ми розглядаємо деякі випадки поглинання в ультрафіолетовій області, використовувані поруч фармакопей для визначення автентичності органічних лікарських речовин.

Вказівка довжин хвиль при максимумах поглинання є лише орієнтовною характеристикою, так як не дає можливості судити про вид спектра.

, 002% розчин препарату в 0, 01 Н розчині соляної кислоти в області від 220 до 350 нм має максимум поглинання близько 251 нм (Имизин, ГФХ).

В даному випадку, очевидно, слід або цілком проміряти зазначену область, що за відсутності реєструючого приладу вимагає значного часу, або зробити ряд вимірювань в області, близької до 251 нм, наприклад ± 10 нм, і встановити максимум.

Найчастіше призводять максимуми і мінімуми при певних довжинах хвиль і відповідні величини поглинання.

Ультрафіолетовий спектр розчину в 0, 1 Н соляній кислоті має два максимуми - при 241 нм і при 291 нм, поглинання 0, 001% розчину при товщині шару 1 см при 241 нм, близько 0, 50 і при 291 нм, близько 0, 67. (Антазоліна гідрохлорид, Міжнародна фармакопея, Друге видання).

Іноді величину поглинання виражають у вигляді питомої показника поглинання, Е (1%, 1 см).

Питомий показник поглинання, Е (1%, 1 см), при довжині хвилі 278 нм 290-305 (0, 002% водний розчин) (Левоміцетин, ГФХ).

Якщо крива поглинання змінюється в залежності від pH розчину, вказують значення pH, при якому проводиться вимірювання.

Ультрафіолетовий спектр розчину в фосфатному буфері, pH 7, 5, має максимум тільки при 252 нм, поглинання 0, 0005 розчину при товщині шару 1 см близько 0, 4 (Сульфафуразол, Міжнародна фармакопея, Друге видання).

Розчин в 0, 01 н. їдкому натре має максимум при 326 нм, Е (1%, 1 см) - близько 65, і мінімум при 294 нм, Е (1%, 1 см) - близько 35.

Розчин в суміші 10 обсягів 0, 1 Н соляної кислоти і 40 об'ємів 95% спирту, доведених водою до 100 мл, має максимум при 300 нм, Е (1%, 1 см) - близько 50, і мінімум при 275 нм, Е (1 %, 1 см) - близько 40 (Левотироксин-натрій, Скандинавська фармакопея).

Деякі фармакопеї замість абсолютних величин поглинання приймають ставлення адсорбції при максимумі до абсорбції при мінімумі, що дає можливість до певної міри судити про наявність поглинаючих домішок.

, 001% розчин препарату в 0, 1 Н розчині їдкого натра має максимуми поглинання при 256, 283 і 365 нм. Відношення D при 256 нм до D при 365 нм становить 2, 8-3, 0 (Фолієва кислота, ГФХ).

Для феноксіметілпеннціілліна за тією ж фармакопеї проводять вимірювання наступним чином.

Близько 0, 1 г препарату (точна наважка) розчиняють у 4 мл 5% розчину гідрокарбонату натрію, розводять водою до 500 мл і визначають оптичну щільність (D) при довжині хвилі 268 нм і при довжині хвилі 274 нм в кюветі з товщиною шару 1 см . Контрольним розчином служать 4 мл 5% розчину гідрокарбонату натрію, розведені водою до 500 мл.

Відношення D при довжині хвилі 268 нм до D при довжині хвилі 274 їм повинно бути не менше 1, 21 і не більше 1, 24.

Ультрафіолетовий спектр 0, 0005% розчину у спирті має максимуми і мінімуми яри тих же довжинах хвиль, що н розчин стандарту, однакової концентрації і одночасно виміряний; відповідні величини поглинання, розраховані на суху речовину, при максимумі поглинання близько 281 нм не відрізняються більш ніж на 3% (Егінілестрадіол, Фармакопея США XVII).

Останній метод забезпечує найбільш достовірні результати і має бути рекомендований для фармакопейних випробувань на справжність.

Випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі.

Метод спектрофотометрії в ультрафіолетовій області успішно використовується як для ідентифікації та кількісного визначення, так і у випробуваннях на чистоту.

Застосування ультрафіолетової спектрофотометрії для перевірки доброякісності фармакопейних препаратів є найбільш цінним у випадках, коли домішки або продукти розкладання поглинають в області, відмінній від досліджуваного речовини. Таким чином визначають зміст адреналона, що має максимум при 310 нм, в адреналіні, максимум поглинання при 278 нм.

Вказуються у фармакопейних статтях величини поглинання, що визначають граничний вміст домішки, встановлюються емпіричним шляхом.

-оксіфенілтріметіламмоній бромід, супутній неостігміну броміду, має максимум при 294 нм.

Поглинання 0, 05% розчину в 0, 1 М карбонат натрію при 294 нм не більш 0, 03 - межа вмісту 3 мг на 1 г (Неостнгмнн бромід, Скандинавська фармакопея).

Аналогічно визначається зміст гітоксін в дигітоксин з Міжнародної фармакопеї Другого видання.

Розчиняють близько 5 мг препарату (точна наважка) в 1 мл метилового спирту і доводять гліцерином або концентрованою соляною кислотою до обсягу 25 мл. Поглинання цього розчину після години стояння при 352 нм близько 0, 28 (не більше 5%).

Межа змісту поглинаючих домішок може бути встановлена за величиною відносин абсорбції при різних максимумах. При аналізі ціаіокобаламіна по Державній фармакопеї X видання визначають оптичну щільність (D) розчину, приготованого для кількісного визначення в кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 278, 361 і 548 нм.