Материал: Методи спектрофотометрії

Методи спектрофотометрії

Зміст

Вступ

. Загальна теорія поглинання світла молекулами

2. Апаратура для вимірювання поглинання у видимому та ультрафіолетовому світлі

2.1 Спектрофотометри

3. Методика спектрофотометричних вимірювань

4. Фактори, що впливають на абсорбціонні властивості хромофора

4.1 Ефект рН

4.2 Ефект полярності

4.3 Ефекти орієнтації

5. Застосування абсорбційної спектроскопії у видимій і УФ-областях спектра

5.1 Приклад 1. Вимірювання концентрації

5.2 Приклад 2. Дослідження хімічних реакцій

5.3 Приклад3. Спектрофотометричне титрування білків

5.4 Приклад 4. Асоціація білка

5.5 Приклад 5.Пертурбація розчинником нуклеїнових кислот

6. Поглинання поляризованого світла

7. Інфрачервона спектроскопія

7.1 Методика вимірювань

7.2 Інформація, що міститься в інфрачервоних спектрах

8. Виявлення фальсифікації органічних лікарських речовин, випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі. Інфрачервоні спектри поглинання та їх застосування для ідентифікації лікарських речовин

Висновки

Список використаної літератури

Вступ

До фізичних та фізико-хімічних методів дослідження відносяться: визначення температур плавлення і кристалізації, а також температурних меж перегонки; визначення густини, показників заломлення (рефрактометрія), оптичного обертання (поляриметрія); спектрофотометрія - ультрафіолетова, інфрачервона; фотоколориметрія, емісійна та атомно-абсорбційна спектрометрія, флуориметрія, спектроскопія ядерного магнітного резонансу, мас-спектрометрія; хроматографія адсорбційна, розподільча, іонообмінна, газова, високоефективна рідинна; електрофорез (фронтальний, зональний, капілярний); електрометричні методи (потенціометричне визначення рН, потенціометричне титрування, амперометричне титрування, вольтамперометрія).

Спектрофотометрія- це сукупність методів визначення кількісних характеристик монохроматичного випромінювання. Спектральна фотометрія дає методи отримання спектрів випромінювання, відбивання, пропускання, поглинання і розсіювання. Вони виражаються графічними залежностями розподілення відповідних величин за довжинами хвиль або частотами випромінювання.

Спектрофотометрія (абсорбційна) фізико-хімічний метод дослідження розчинів і твердих речовин, заснований на вивченні спектрів поглинання в ультрафіолетовій (200-400 нм), видимої (400-760 нм) та інфрачервоній (> 760 нм) областях спектра. Основна залежність, яка вивчалася в спектрофотометрії залежність інтенсивності поглинання падаючого світла від довжини хвилі.

Спектрофотометрія широко застосовується при вивченні будови і складу різних сполук (комплексів, барвників, аналітичних реагентів тощо), для якісного і кількісного визначення речовин (визначення слідів елементів в металах, сплавах, технічних об'єктах, лікарських препаратах).

1. Загальна теорія поглинання світла молекулами

світло поглинання спектрофотометричний поляризований

Світлова хвиля складається із взаємно перпендикулярних електричного і магнітного полів, амплітуди яких по мірі розповсюдження змінюються по синусоїді (рис 1-1).

Рис1-1.Розповсюдження електромагнітної хвилі в просторі. Вектори Е і Н взаємно перпендикулярні.

Енергія хвилі Е рівна:

де h- постійна Планки, c швидкість світла, λ- довжина хвилі, v- частота .Коли хвиля стикається з молекулою вона може або розсіюватися або ж поглинатися .Якщо відбулося поглинання електромагнітної енергії світла, то про молекулу говорять що вона збудженна, або перейшла в збуджений стан .Молекула або частина молекули, яка може бути збуджена шляхом поглинання світла в видимій і ближній УФ- області, називається хромофором .Зазвичай енергія збудження перетворюється в тепло (кінетичну енергію) в результаті зіткнення збудженої молекули з іншою молекулою (наприклад, молекулою розчинника). У випадку деяких молекул вона знову випромінюється

У двох випадках інтенсивність світла, що пройшла через молекулу, що містить набір хромофорів, менше інтенсивності падаючого світла.

Збуджена молекула має набір дискретних квантових енергетичних станів, що описуються законами квантової механіки. Ці стани називаються енергетичними рівнями молекули. Головні енергетичні рівні визначаються можливим просторовим розподілом електронів і називаються електронними енергетичними рівнями; на них накладаються коливальні рівні, які вказують на різні типи коливань. Енергетичні рівні зазвичай описуються схемою енергетичних рівнів (рис. 1-2). Самий нижчий електронний рівень називається основним станом, а всі інші - збудженими. Поглинання енергії відбувається з найбільшою ймовірністю тільки в тому випадку, якщо кількість поглинальної енергії відповідає різниці енергій квантових станів .

Рис1-2 . Відстань між електронами і ядрами або між атомами в молекулі.

Типова схема енергетичних рівнів, на якій відображено основний стан (1) і перший збуджений стан (2). Тонкими горизонтальними лініями показані коливальні рівні (3).Довша стрілка вказує на можливий електронний перехід між основним станом і четвертим коливальним рівнем першого збудженого стану. Коротша стрілка означає перехід з одного коливального рівня на другий в межах основного стану. Зміна енергетичного стану при випущенні або поглинанні кванта називається переходом .Спрощено перехід між електронними енергетичними рівнями відповідає енергії, необхідної для переміщення електрона з одної орбіталі на іншу. На схемі енергетичних рівнів переходи зображаються вертикальними стрілками. Залежність імовірності поглинання від довжини хвилі називається спектром поглинання . Завдання абсорбційної спектроскопії полягає в накопиченні та аналізі даних по поглинанню. Якби всі переходи відбувалися тільки між найнижчими коливальними рівнями основного стану та першого збудженого стану, тоді спектр поглинання складався б з вузьких, дискретних ліній. Однак, оскільки можливі переходи з основного стану на будь коливальний і обертальний рівні першого збудженого стану, а лінії мають кінцеву ширину, то спектр проявляється у вигляді відносно плавної кривої.Для більшості молекул довжини хвиль, відповідних переходів між основним станом і будь-яким коливальним рівнем

Рис 1-3.Частина електромагнітного спектра, використовувана для досліджень в області фізичної біохімії.

першого збудженого стану, лежать в ультрафіолетовій і видимій області спектра. Можливі також низькі за енергією переходи між коливальними рівнями в межах одного електронного рівня. Ці переходи відбуваються в результаті поглинання випромінювання в інфрачервоній області. На рис. 14-3 показана частина електромагнітного спектра на якій позначені переходи, які виникають при поглинанні випромінювання в різних діапазонах частот.

Імовірність переходу при одній довжині хвилі характеризується молярним коефіцієнтом поглинання при цій довжині хвилі. Щоб визначити цей параметр, розглянемо, як він вимірюється. Якщо світло інтенсивності I, проходить через розчин з товщиною шару d і концентрацією с, інтенсивність про ходячого світла I підкоряється закону Ламберта - Бера:

де - молярний коефіцієнт погашення .Результати вимірювання виражають або як відсоток пропускання (100х -), або, набагато частіше, як поглинання А (lg ). Коли d = 1 см, А називають ОD або оптичною щільністю,

Рис 1-4.

Позитивне і негативне відхилення від закону Бера та причини відхилень .- спектральний зсув, пов'язаний зі зростанням концентрації, часто в результаті полімерезаціі . Зазначимо, що при довжині хвилі λ2 не спостерігається зміни молярного коефіцієнта погашення при зміні концентрації, б - крива, що показує відхилення від закону Бера. При відхилення позитивне (1), при λ3 - негативне (2). індекс λ вказує довжину хвилі, при якій проводиться вимірювання. Оптичною щільністю зручно користуватися, так як вона дорівнює E*C.

2. Апаратура для вимірювання поглинання у видимому та ультрафіолетовому світлі

2.1 Спектрофотометри

Вимірювання поглинання в ультрафіолетовій і видимій областях проводиться на фотоелектричних спектрофотометрах. У Радянському Союзі випускалися однопроменеві, призмові, не регіструючі прилади СФ-4 і СФ-4А для вимірів в ультрафіолетовій, видимій та ближній інфрачервоній областях спектру (від 220 до 1100 нм), не регіструючий прилад з дифракційними решітками СФД-2 для вимірювань від 220 до 1100 нм, однопроменевий, призменний спектрофотометр СФ-5М для вимірювань від 380 до 1100 нм, і двопроменеві, призмові, реєструючі прилади СФ-2М і СФ-10 для вимірів у видимій частині спектру від 400 до 750 нм. За кордоном і в сучасній Україні використовуються реєструючі спектрофотометри типу Бекман (США), Перкін-Елмер (США), Уніка (Англія), Хілгер-Увіспек (Англія), Цейс (НДР) та інші серійні прилади. Основними частинами будь-якого спектрофотометра є : 1.джерело безперервного випромінювання;

.монохроматор;

.кювета для аналізованого розчину;

. детектор ;

. реєструючий пристрій.

Оптична схема найпростішого спектрофотометра наведена на рис. 2.:

Рис.2 Оптична схема простого спектрофотометра.

.джерело випромінювання; 2.дзеркало; 3.вхідна і вихідна щілини, 4.дзеркало; 5.призма; 6.поворотне дзеркало, 7.кювета, 8.фотоелемент.

Як джерело випромінювання в приладах найбільш широко використовуються газорозрядна воднева лампа і вольфрамова лампа розжарювання.

Газорозрядна воднева лампа забезпечує суцільний спектр в ультрафіолетовій області і особливо зручна для вимірів від 200 до 350 нм.

Вольфрамова лампа розжарювання використовується для роботи в ближній ультрафіолетовій області, видимої та ближньої інфрачервоної області, тобто в межах від 320 до 3000 нм. Ртутні лампи забезпечують дуже високу інтенсивність в ультрафіолетовій і видимій областях, даючи інтенсивну лінію спектру ртуті і суцільне випромінювання. Ртутні лампи необхідно нагрівати протягом 15 хвилин, перш ніж вони почнуть давати постійне випромінювання. Недоліком є висока температура, яку ртутна лампа набуває при роботі.

Ксенонові розрядні лампи застосовуються в ряді приладів для вимірювань в області від 200 до 900 нм.

Монохроматор пристосування для ізолювання дуже вузької смуги випромінювання; з джерела світла. Змішане випромінювання проходить через щілину в монохроматор, в якому промінь розкладається на спектр за допомогою призми або дифракційної решітки. Цей спектр фокусується на вихід щілини. Шляхом обертання призми або дифракційної решітки можна виділити певну частину спектру, яка через щілину направляється в кюветне відділення, де знаходиться розчин досліджуваної речовини.

Кут відхилення між початковим напрямком променя і напрямом, в якому він проходить через призму, залежить від показника заломлення матеріалу, з якого зроблена призма. Показник заломлення будь-якого матеріалу змінюється в залежності від довжини хвилі, що визначається наступним рівнянням:

n = n0 + C / (λ - λ0),

де n - показник заломлення при визначеній довжині хвилі;

λ - довжина хвилі;; n0; - константи.

Отже, коли промінь немонохроматичним радіації входить у призму, які становлять його довжини хвиль відхиляються під різними кутами. Той же процес повторюється при виході променя з призми. Таким чином, виходить спектр, в якому короткі хвилі відхиляються від їх початкового напрямку більше, ніж довгі.

Роздільна сила призми визначається здатністю інструмента розділяти дві спектральні лінії, що відрізняються на довжину хвилі dλ.

R = λ / dλ = t * dn / dλ

де λ-середня довжина хвилі двох ліній, незначно відрізняються один від одного;

dλ - відмінність в довжинах хвиль двох ліній;- товщина основи призми;- показник заломлення призми.

Матеріал, з якого виготовляються призми, вибирається з розрахунком отримання максимальної дисперсії і хорошою пропускною здатністю в певній області спектра. Призми зі скла використовуються у видимій області, з кварцу - в ультрафіолетовій і ближній інфрачервоній області. Призми в порівнянні з дифракційними решітками забезпечують чистіший спектр.

Дифракційні гратки дешевші, ніж призми, і можуть бути використані для всіх областей спектра, так як пропускна здатність в даному випадку не має визначального значення. Дифракційна решітка складається з великої кількості паралельних ліній, нанесених на скло або на поверхню металу. Спектри, одержувані з дифракційними решітками, не так чисті, як призмові, тому, що утворюється спектр більш ніж одного "порядку".

Коли світло відбивається від дифракційної поверхні, спектри утворюються на обох сторонах перпендикуляра у відповідності з наступним рівнянням:

n * λ = d * (sin i + sin Θ),

де n - порядок спектра;

λ - довжина хвилі;- відстань між лініями дифракційної решітки;- кут падіння;

Θ - кут дифракції.

Дисперсія від дифракції залишається практично постійною при зміні довжини хвилі, а роздільна сила решітки визначається порядком спектра і числом ліній на освітленій частині дифракційної решітки.

R = n * N,

де R - роздільна сила решітки;- порядок спектра;- число ліній.

Роздільна сила також залежить від якості дифракційної решітки. Будь-які недоліки в точності нанесення ліній можуть привести до появи кілька зміщеного зображення ліній. Зазвичай отримують спектр дещо вищого порядку, ніж очікуваний.Для обох систем диспергування світла необхідні колімінуючі та фокусуючі лінзи або дзеркала, зазвичай комбіновані з диспергуючим пристроєм.У абсорбційній спектроскопії застосовуються кювети різних розмірів, виготовлені з кварцу або скла. Як і призми, кювети зроблені з матеріалу, що володіє високою пропускною здатністю в певної частини спектра. Кварцові кювети придатні для вимірювань як ультрафіолетової, так і у видимій області; скляні ж можуть бути використані тільки у видимій області.

Товщина шару в кюветах коливається від 0, 1 до 10 см. Найчастіше вимірювання проводять в кюветах з товщиною шару 1 см. Важко робити кювети, абсолютно ідентичні за пропускною здатністю, тому одну і ту ж кювету зазвичай використовують тільки для розчинника. Поправка на різне поглинання кювет визначається шляхом порівняння поглинання обох кювет, наповнених чистим розчинником.Слід звертати увагу на чистоту кювет та стан їх оптичної поверхні, так як обидва ці чинники впливають на показання поглинання.Для вимірювання поглинання світла необхідно фотометричний пристрій. Застосовувані для цих цілей фотоелементи, фотоемісійні лампи і фотопомножувачі засновані на відомому ефекті переходу світлової енергії в електричну.Фотоелементи дають відносно сильний струм, який може бути визначений за допомогою гальванометра. Фотоелементи найчастіше застосовуються в фотоелектроколориметр.

Фотоемісійні лампи - це розріджені трубки, що містять два електроди, один з яких при опроміненні випускає електрони, так як покритий світлочутливим матеріалом (лужний метал, нанесений на шар окису срібла або сурми). Виникає при цьому струм дуже слабкий, тому необхідно застосовувати підсилювальні пристрої.

Емісійні лампи застосовують по наступних основних причинах. Внаслідок низького внутрішнього опору посилення струму в фотоелементі утруднено. В спектрофотометрі використовується більш вузький промінь світла, ніж у колориметрі, завдяки чому струм у фотоелементі був би занадто слабкий для вимірювання. Потік фотоелемента, який піддається постійному висвітленню, повільно знижується в часі. Нарешті, спектральна відповідь фотоелементів обмежується видимою частиною спектра, фотоелементи майже марні в ультрафіолетовій області.Природа покриття визначає область хвиль, в якій емісійна лампа може бути використана (від 300 до 500 нм для шару металевого натрію і від 200 до 700 нм для шару калію).Фотопомножувачі пристроїв є подальшим розвитком фотоемісійних ламп. Первинні електрони, що випускаються фоточутливим електродом, спрямовуються на наступний електрод, який в свою чергу випускає кілька електронів на кожен падаючий на нього електрон і т. д. Після низки таких етапів вдається значно посилити струм при збереженні дуже невеликої величини початкового струму.