Автореферат: Метаболические эффекты дельта-сон индуцирующего пептида в регуляции гомеостаза при старении организма

При обнаружении у крыс опухолевого роста или воспалительных процессов их исключали из опыта. При применении геропротекторных средств важным аспектом их действия на организм является влияние на массу тела, при этом считается, что они не должны приводить к ее увеличению. Длительное введение ДСИП животным разного возраста не приводило к возрастанию массы тела, а у 18 и 24 мес. животных незначительно уменьшало ее.

В эксперименте использовали синтетический аналог ДСИП, синтезированный в Институте органической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва).

Таблица

Дизайн эксперимента

Подопытных и контрольных животных декапитировали в утренние часы, чтобы избежать суточных колебаний метаболизма. Исследуемые показатели определяли в супернатантах гомогенатов мозга и печени (вес/объем), приготовленных на физиологическом растворе и обработанных тритоном Х-100 (конечная концентрация 0,1%), супернатанте гомогената печени, приготовленного на 0,25 М сахарозе, эритроцитах, плазме/сыворотке крови.

Содержание МДА определяли тиобарбитуровым методом (Стальная, Гаришвили, 1977), активность СОД - по методу Сироты Т.В. (1999), каталазы - методом Королюка М.А. и др. (1988). Содержание белка в гомогенатах тканей определяли биуретовым методом («Клини Тест-ОБ», «Эко-сервис», Россия), гемоглобина - гемихромным методом («Гемоглобин-Ново», «Вектор-Бест», Россия). Активность ЦП определяли методом Равина (Камышников, 2004). Содержание мочевины определяли диацетилмонооксимовым методом («UREA 450», PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехия), мочевой кислоты - по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом («КлиниТест-МК», «Эко-Сервис», Россия). Содержание ВЭГ определяли цианметгемоглобиновым методом («Клини-Тест-Гем» К800, «Эко-сервис», Россия), СПА - по Покровскому А.А. (1969), железа - по реакции с феррозином («Железо-НОВО», «Вектор-Бест», Россия). Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом («Глюкоза - ФКД», «ФКД», Россия), гликозилированного гемоглобина - по реакции с тиобарбитуровой кислотой («GHB 100», PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехия). Содержание общих липидов определяли сульфованилиновым методом («TL 180», PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехия), общего холестерина и холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) - по реакции с холестериэстеразой («ЭКОлаб-Холестерин», «ЭКОлаб-Холестерин ЛПВП», «Эко-сервис», Россия). Коэффициент атерогенности рассчитывали по формуле (Камышников, 2004): К_А = (ОХ - б-ХС)/б-ХС, где ОХ - общий холестерин, б-ХС - холестерин ЛПВП. Активность аланинаминтрансферазы (АлТ) и аспартатаминтрансферазы (АсТ) определяли динитрофенилгидразиновым методом («Трансаминаза-АлТ-Ново», «Трансаминаза-АсТ-Ново», «Вектор-Бест», Россия), щелочной фосфатазы (ЩФ) - паранитрофенилфосфатным методом («Новофосфал», «Вектор-Бест», Россия), б-амилазы - амилокластическим методом (по Каравею) («Клинитест-альфа-амилаза», «Эко-Сервис», Россия).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы статистического анализа BIOSTAT 2008. Достоверность различий между опытными и контрольными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Отклонения между рядами считали достоверными при p?0,05-0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ДСИП на интенсивность свободнорадикальных процессов в мозге, печени и крови крыс при старении организма. Нами зарегистрировано возрастание интенсивности ПОЛ, выраженное в накоплении МДА в мозге, печени и плазме крови крыс, в ходе их индивидуального развития. Наибольшее повышение содержания МДА имеет место в мозге 6-24 мес. животных (рис. 1), что, вероятно, объясняется особенностями метаболизма данной ткани: у 6 мес. - на 60,1%,12 мес. - на 74,6%, 16 мес. - 46,8%, 18 мес. - на 83,8%, 20 мес. - на 79,1%, 22 мес. - на 88,1%, 24 мес. - на 130,5% по сравнению с 2 мес. животными.

Примечание: на рис. 1-25 * - достоверные различия по сравнению с 2-х месячными животными (р₁<0,05-0,001); ** - тоже по сравнению с животными предшествующей возрастной группы (p₂<0,05-0,001); *** - тоже по сравнению с животными соответствующего возраста без введения ДСИП (p₃<0,05-0,001).

В печени и плазме крови эти изменения имеют более неоднородный характер по возрастным группам (рис. 2, 3). В печени 2 мес. крыс концентрация МДА довольно высока. По сравнению с ними в печени 4, 6, 12 и 18 мес. животных содержание исследуемого вторичного продукта ПОЛ снижено, значительно повышаясь лишь в печени 22 и 24 мес. животных - на 45,7% и 63,7%, соответственно. В плазме крови наибольшее значение исследуемого показателя зарегистрировано у животных 12, 18, 20, 22 и 24 мес. возрастных групп, у которых содержание МДА выше по сравнению с 2 мес. животными на 41,3%, 25,3%, 40,5% и 39,4%, соответственно.

ДСИП оказывает существенное влияние на систему свободнорадикальных процессов, выступающую ключевым метаболическим звеном и маркером функционального состояния организма, о чем свидетельствует снижение содержания МДА в мозге, печени и плазме крови крыс разного возраста. Уровень МДА в головном мозге 6 мес. животных снижается на 34,6%, 8 мес. - на 15,1%, 12 мес. - на 31,2%, 18 мес. - на 44,5%, 20 мес. - на 39,3%, 22 мес. - на 44,2%, и 24 мес. - на 53,4% по сравнению с интактными животными соответствующего возраста (рис. 1). В печени 4, 6, 12, 16, 20, 22 и 24 мес. животных уровень исследуемого показателя на фоне введения пептида снижается на 42,2%, 35,2%, 32,6%, 38,7%, 45,5%, 44,3% и 45,5%, соответственно, по сравнению с интактными животными этого же возраста (рис. 2), в плазме крови 6 мес. крыс - на 41,2%, 12 мес. - на 18,8%, 16 мес. - на 21,6%, 18 мес. - на 51,7%, 20 мес. - на 39,4%, 22 мес. - на 56,7% и 24 мес. - на 54%, соответственно, по сравнению с интактными животными той же возрастной группы (рис. 3).

Таким образом, ДСИП одинаково эффективно осуществляет свое протекторное действие во всех исследованных тканях, имея наиболее выраженный (в процентном отношении) эффект у животных в позднем онтогенезе (18, 20, 22 и 24 мес.). Предупреждение возрастной активации ПОЛ в тканях и плазме крови крыс на фоне введения ДСИП может быть связано с ингибированием наработки активированных кислородных метаболитов (АКМ) и активацией антиоксидантных защитных механизмов организма.

Ферментативные антиоксиданты - СОД и каталаза являются первым звеном внутриклеточной защиты от активных форм кислорода (АФК). Старение организма характеризуется существенным снижением емкости ферментативной АОС, о чем свидетельствует зарегистрированное нами ингибирование активности АО ферментов СОД и каталазы в мозге, печени и эритроцитах крови крыс разного возраста. Наибольшая активность СОД обнаружена нами в мозге 4 и 6 мес. животных, где она выше по сравнению с 2 мес. крысами, тогда как в мозге 8, 12, 16, 18, 20, 22 и 24 мес. животных активность данного фермента снижена на 40,4%, 32,5%, 37,1%, 37,2%, 52,2%, 59,2% и 58,7%, соответственно, по сравнению с 2 мес. животными (рис. 4).

Активность каталазы в мозге крыс в ходе онтогенеза имеет несколько иную динамику (рис. 5). Максимальная активность зарегистрирована в мозге 8, 12, 16 и 18 мес. крыс, у которых она достоверно выше по сравнению с 2 мес. животными, тогда как в мозге 4, 6, а также в мозге животных 20, 22 и 24 мес. возраста она достоверно не отличается от 2 мес. При этом нужно отметить, что в мозге 18, 20, 22 и 24 мес. крыс активность данного фермента по отношению к предшествующей возрастной группе все же снижается на 14,3%, 18,8%, 27,6% и 43%, соответственно.

В печени исследованных животных возрастная динамика активности данных ферментов практически одинакова (рис. 6, 7). Так, активность СОД в печени 6, 8, 12 и 16 мес., а каталазы в печени 6, 8, 12, 16 мес. крыс выше по сравнению с 2 мес. животными. Снижение активности СОД и каталазы зарегистрировано нами в печени 22 и 24 мес. животных по сравнению с 2 мес. крысами на 19%, 18,2% и 23,3%, 19,6%, соответственно.

Возрастное снижение активности СОД и каталазы зарегистрировано в эритроцитах исследованных животных (рис. 8, 9). Активность СОД в эритроцитах 8, 18, 20, 22 и 24 мес. животных снижена (по отношению к ее активности в эритроцитах 2 мес. крыс) на 20,3%, 20,4%, 19,7%, 20,7%, 36,7%, соответственно. Наибольшая активность каталазы обнаружена в эритроцитах 8, 12 и 16 мес. животных, у которых она выше по сравнению с 2 мес., тогда как в эритроцитах 20, 22 и 24 мес. животных активность данного фермента по сравнению с 2 мес. крысами снижается на 28,4%, 22,6% и 32,5%, соответственно.

Отмеченное нами при старении снижение активности АО ферментов мозга, печени и эритроцитов, очевидно, обусловлено ингибирующим действием АФК, вызывающим окислительную модификацию и конформационные изменения молекул ферментов, а также нарушением их синтеза и распада в процессе старения клеток.

Введение ДСИП животным разного возраста приводит к повышению активности СОД в ткани мозга 6 мес. крыс на 16,4%, 8 мес. - на 73,6%, 12 мес. - на 117,2%, 16 мес. - на 118%, 18 мес. - на 127,5%, 20 мес. - на 172,7%, 22 мес. - на 202,7%, 24 мес. - на 191% по сравнению с интактными животными соответствующего возраста (рис. 4), а также к повышению активности каталазы в мозге всех исследованных возрастных групп (рис. 5), особенно у 18, 20, 22 и 24 мес. животных - на 60,7%, 61,1%, 102,8% и 200%, соответственно, по сравнению с интактными животными того же возраста. Нами также отмечено возрастание активности СОД на фоне введения ДСИП в печени всех исследованных возрастных групп (рис. 6), особенно значительное для 16, 18, 20, 22 и 24 мес. животных - на 103,3%, 126%, 116,1%, 185,7% и 176%, соответственно, по отношению к интактным крысам тех же возрастных групп. ДСИП приводит также к увеличению активности каталазы в печени практически всех исследованных возрастных групп животных (рис. 7), при этом наибольшее повышение имеет место у 22 мес. и 24 мес. крыс - на 109,1% и 104,5%, соответственно, по сравнению с интактными животными того же возраста. В эритроцитах активность СОД и каталазы при введении ДСИП повышается во всех исследованных возрастных группах животных. Максимальное повышение активности СОД и каталазы выявлено в эритроцитах 12, 16, 18, 20, 22 и 24 мес. животных (рис. 9).

Таким образом, на фоне введения ДСИП животным разного возраста отмечается повышение активности СОД и каталазы в мозге, печени и эритроцитах крови крыс, максимальное возрастание их активности имеет место в тканях 18, 20, 22 и 24 мес. крыс, при этом в мозге и печени в процентном отношении ДСИП в большей степени активирует СОД, нежели каталазу, тогда как в эритроцитах, наоборот, имеет место более интенсивная модуляция активности каталазы. ДСИП, обладая антиоксидантным эффектом, ликвидирует дефицит данных ферментов, способствуя поддержанию прооксидантно-антиоксидантного баланса. Установленное нами увеличение активности ферментативной АОС тканей мозга, печени и эритроцитов животных под влиянием ДСИП может быть следствием активации синтеза пептидом дельта-сна исследуемых соединений как непосредственно, где ДСИП может выступать в роли регулятора транскрипции генов специфических областей ДНК, ответственных за образование АО ферментов, так и опосредованно через гормональную систему. Установлено влияние ДСИП на уровень мелатонина в организме крыс. Мелатонин, как известно, является эффективным антиоксидантом, значительно повышает активность СОД, каталазы в тканях старых животных (Gonca Akbulut et al., 1999).

Считается, что в плазме крови главным ингибитором супероксидного аниона является специфический белок крови - церулоплазмин. Нами зарегистрировано снижение активности ЦП в плазме крови 16, 18 и 24 мес. животных на 15,5%, 14% и 23,8%, соответственно, по сравнению с 2 мес. крысами, тогда как в плазме крови остальных исследованных возрастных групп животных содержание данного показателя достоверно не изменяется (рис. 10). Регулярное подкожное введение ДСИП животным разного возраста приводит к умеренному повышению активности ЦП в плазме крови 16 мес. крыс на 27%,18 мес. - на 25,9%, 20 мес. - на 24,3%, 22 мес. - на 27,5% и 24 мес. - на 26,8% по сравнению с интактными животными соответствующих возрастов. В остальных возрастных группах введение ДСИП не приводит к достоверным изменениям исследуемого показателя (рис. 10). Можно предположить непосредственное модифицирующее действие ДСИП путем регуляции пептидом синтеза данного белка и его высвобождения из гепатоцитов.

Низкомолекулярные азотсодержащие метаболиты - мочевина и МК играют важную регуляторную роль в организме и выступают в качестве одного из важнейших звеньев неферментативной антиоксидантной защиты. Результаты исследования свидетельствуют о возрастном повышении содержания мочевины и МК в мозге, печени и плазме крови в онтогенезе исследованных животных.

Концентрация мочевины и МК в мозге всех исследованных возрастных групп животных достоверно выше по сравнению с 2 мес. животными (рис. 11, 12).

При этом нужно отметить, что наибольшее повышение мочевины в процентном отношении имеет место в мозге 8 и 16 мес. крыс по сравнению с 2 мес. крысами и составляет 142,3% и 143,5%, соответственно, тогда как в мозге 20, 22 и 24 мес. животных процент возрастания гораздо ниже. Кроме того, содержание данного низкомолекулярного АО в мозге 6, 12, 18, 20, 22 и 24 мес. крыс достоверно не изменяется по сравнению с предшествующей возрастной группой, т.е. повышаясь у взрослых животных, далее остается примерно на одном уровне. Содержание МК также повышено в мозге практически всех исследованных возрастных групп животных по сравнению с 2 мес. животными. Наибольшее возрастание данного показателя имеет место в мозге 12, 16 и 18 мес. животных, у которых уровень МК на 117,5%, 181% и 127% выше по сравнению с 2 мес. крысами, при этом в мозге 18, 20, 22 и 24 мес. животных концентрация МК ниже по отношению к предшествующей возрастной группе для каждого указанного возраста.

В ткани печени крыс возрастная динамика исследованных низкомолекулярных АО также характеризуется возрастанием их содержания в ходе онтогенеза (рис. 13, 14).