Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга
мутационный груз
цитогенетический мониторинг
Введение
В состав генетического мониторинга входит цитогенетический мониторинг, задачей которого является регистрация возникающих под действием антропогенных факторов изменений в структуре генофонда и прогнозирование темпов ее перестройки[3]. Но цитогенетический мониторинг может быть использован не только как составляющая часть генетического мониторинга. В экологическом мониторинге он дополняет генетические данные и результаты исследований по воздействию загрязнителей и позволяет решить две задачи: составить полную картину при экспертизе биологических последствий загрязнения, оценить роль антропогенных воздействий на стабильность сортов растений, от которых зависит их продуктивность[1].
Мутационный груз, возникающий в растительных популяциях в результате влияния антропогенной нагрузки, можно сравнительно быстро определить с помощью современных цитогенетических методов, используя один из основных цитогенетических критериев - частоту клеток с перестройками хромосом в первых митозах меристемы корней. Это позволяет установить различия между популяциями из загрязненных и контрольных районов[2]. Учет аберраций хромосом можно проводить на стадии метафазы (метафазный метод) или на стадии поздней анафазы и ранней телофазы (ана-телофазный метод). Оба метода имеют как преимущества, так и недостатки.
Метафазный метод более точен. Он дает возможность выявить в 1,5 раза больше мутаций и позволяет учесть с предельной точностью все типы хромосомных и хроматидных перестроек, а также геномные мутации. Вместе с тем он является достаточно трудоемким и связан с определенными ограничениями в выборе объектов для исследований. Так, наиболее результативен он при использовании видов с небольшим числом крупных, хорошо идентифицируемых хромосом. Создаются затруднения при изготовлении давленых препаратов высокого качества [4].
При использовании ана-телофазного метода для
анализа пригодна почти каждая делящаяся клетка. Этот метод менее точен. Он
позволяет учесть лишь некоторые типы хромосомных аберраций. Его принято считать
экспресс-методом для предварительной оценки активности тех или иных агентов.
Тем не менее, ана-телофазный метод широко применяется для выявления мутагенных
эффектов [5].
1. Учет хромосомных аберраций в
митозе и механизмы их образования
В основе структурных перестроек лежит свойственная всем хромосомам способность при определенных условиях разрываться на части, фрагментироваться [6].Происхождение и судьба разных типов аберраций хромосом неодинакова. Одним из наиболее важных факторов принято считать установление зависимости между митотическим циклом и реакцией хромосом на действие антропогенной нагрузки. В результате антропогенного воздействия на хромосомы на разных стадиях ядерного цикла образуются разные типы перестроек, которые обусловлены, в основном, самой структурой хромосом в каждой данной стадии. В стадии G1 хромосома ведет себя как отдельная нить. Возникают межхромосомные обмены, кольца, хромосомные делеции и сложные хромосомные перестройки. В стадию S хромосома обнаруживает двойственную структуру, субнити которой ведут себя самостоятельно, образуя полухроматидные концевые делеции, полухроматидные межхромосомные обмены (транслокации), полухроматидные интерстициальные делеции (микрофрагменты), изо- полухроматидные делеции, а также полухроматидно-изополухроматидные трирадиалы.
В стадию G2 образуются хроматидные перестройки: концевые делеции, изосестринские делеции, симметричные и ассиметричные межхромосомные хроматидные обмены, трирадиалы[7]. При повреждении двухроматидной хромосомы образуется ацентрический фрагмент и укороченная хромосома. Если при соединении разорванных концов исходная структура восстанавливается, то никаких перестроек не происходит. При двух близких одновременных разрывах случайное соединение четырех свободных концов обуславливает различные аберрации обменного типа. В анафазе - телофазе митоза фрагмент обнаруживается между полюсами. Судьба фрагментов ( одиночных и множественных) различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, резорбироваться или образовывать дополнительное микроядро[8]. Мост является следствием фрагментации двух хромосом. При воссоединении фрагментов, содержащих центромеры, образуется дицентрическая хромосома, которая испытывает воздействие обоих митотических центров, и, растягиваясь между дочерними группами анафазных-телофазных хромосом, образует мост. Аналогично на стадии G2 и S образуется хроматидный мост [9].
Отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникают при повреждении хромосомы в области кинетохора. Или это может быть связано с действием антропогенных веществ на мембраны митохондрий так, что из этих органелл в цитоплазму выходит кальций. Повышения уровня кальция может подавлять формирование белковых микротрубочек, а следовательно, и образования митотического веретена. Окончательным итогом будет нерасхождение хромосом в митозе. Отставшие хромосомы либо разрушаются и элиминируют из клетки, либо формируют дополнительное микроядро[10].
Перестройки хромосом (хромосомные аберрации, хромосомные мутации) подразделяют на два основных типа: симметричные и асимметричные. Первый тип связан с образованием в результате перестройки отдельных хромосом с одной центромерой, второй - с появлением ацентрических и дицентрических фрагментов.
При анализе перестроек в анафазе учитываются
лишь асимметричные перестройки: фрагменты, кольца ( замкнувшиеся фрагменты,
образовавшиеся в результате двух разрывов), хромосомные и хроматидные мосты.
Мосты могут быть образованы дицентрическими хромосомами, возникающими либо в
результате транслокаций, либо изохроматидных делеций. Могут возникать мосты
также из дицентрических колец [11].
2. Мейотический тест и его
использование в цитогенетическом мониторинге
Ввиду большой чувствительности к внешним
воздействиям, мейоз представляет собой удобную систему для генетического
мониторинга [12]. Анализ мейоза может дать наиболее полную информацию о
генетических последствиях тех или иных воздействий на растения. Клетки
спорогенной ткани дифференцируются на ранних стадиях онтогенеза и развиваются в
течение всего жизненного цикла растения. Большие размеры ядра и хромосом в
профазе мейоза и большая продолжительность мейоза по сравнению с митозом, что
делает ядро в стадии мейоза более чувствительным к антропогенной нагрузке.
Кроме повышения уровня аномалий в мейозе, увеличивается частота полностью
стерильных растений. Отмечено уменьшение числа археспориальных клеток в пыльниках,
дегенеративное изменение пыльцы [13] .
2.1.Влияние ионизирующего излучения
на частоту хромосомных аберраций в мейозе
Чувствительность клеток к излучению может быть разной в связи с различным физическим состоянием молекул в протоплазме. Это обстоятельство имеет большое значение, так как в различные периоды жизнедеятельности клетки физические свойства ее макромолекул и структур меняются.
Опыты по использованию микропучков для облучения отдельных структур и участков клетки показали, что наиболее губительно излучение действует на ядро и хромосомы. В облученных клетках происходят обратимые и необратимые изменения: пикноз ядра, склеивание хромосом, фрагментация хромосом, образование гигантских ядер и многоядерных клеток, нарушение полярности делений, возникновение ядер с различным числом хромосом. Частота и характер хромосомных аберраций зависит от дозы облучения и от того, в какой период митотического и мейотического циклов было произведено облучение. Воздействие возможно в двух состояниях хромосом: 1) на недуплицированные хромосомы (интерфаза, период G1); 2) на дуплицированные хромосомы (профаза, метафаза, период G2 ).
Облучая микроспоры традесканции рентгеновскими лучами, Сакс установил, что при этом возникают простые терминальные делеции и изохроматидные аберрации, частота которых линейно возрастала с увеличением дозы. Выход таких аберраций не зависел от фактора времени. Результаты этих опытов позволили Саксу заключить, что разрывы хромосом, происходящие при облучении, не зависят друг от друга, и частота их прямопропорциональна дозе облучения. Предполагалось, что часть разрывов может остаться невоссоединенной и явиться причиной делеций. Большая же их часть воссоединяется, восстанавливая исходную структуру, а при неправильном слиянии приводит к обмену фрагментами. Обычно в обмене участвуют те разрывы, которые находятся в непосредственной близости друг от друга[14].
Сейчас есть данные о том, что цепи ДНК в процессе репликации подвергаются разрывам. Если эти разрывы заживляются при участии ферментов, осуществляющих пострепликативное восстановление после облучения или последние этапы восстановления по механизму выщепления ресинтеза, то мутации чувствительности к ионизирующим излучениям должны вести к увеличению спонтанной летальности или спонтанной мутабельности.
По классической теории образования аберраций радиация вызывает множество разрывов хромосом,значительная часть которых соединяется.Большинство оставшихся разрывов вовлекается в обмен,а остальные проявляются в метафазе.Таким образом,разрывы хромосом и хроматид рассматриваются как последствия первичного радиобиологического эффекта,который реализуется в ходе интерфазы [13].
Предполагается, что хромосомный тип аберраций возникает при действии облучения до репликации хромосом, а хроматидный - при облучении реплицированных хромосом. Многими исследователями доказано, что период S разделяет время образования хромосомных и хроматидных аберраций. Иначе говоря, облучения в пресинтетический период вызывает аберрации хромосомного типа, а в постсинтетический - хроматидного типа. С наступлением синтетического периода частота хромосомных разрывов резко снижается, а хроматидных - возрастает.
Единственным точным методом оценки действия радиации на живые клетки является прижизненное наблюдение облученных клеток. В данном случае можно непосредственно установить контроль за определенной клеткой сразу после облучения и без малейших погрешностей определить фазу на которой она была облучена. В тех случаях, когда непосредственного наблюдения за облученными клетками установить нельзя, прибегают к фиксации материала через определенное время после облучения. Поскольку учет перестроек хромосом можно производить только в метафазе, анафазе и ранней телофазе, то зная время в момент облучения и в момент фиксации, а также продолжительность каждой фазы, можно высчитать, в какой фазе была облучена клетка [16]. Нужно знать, сколько времени продолжается каждая фаза в цикле клеточного деления каждого растения. Например, для лука репчатого при 20 °С интерфаза продолжается 20 - 26 часов, от ранней профазы до анафазы проходит два часа, анафаза и телофаза вместе длятся около 45 минут, весь цикл деления клетки продолжается 23 - 29 часов. В другом литературном источнике указаны иные данные: общая длительность митотического цикла у Allium cepa составляет 13-15 часов при температуре 24-25 °С.
Зная длительность промежутка времени от момента
облучения до фиксации и наблюдая состояние клетки после фиксации можно
определить, в какой фазе находилось ядро клетки во время облучения. Пыльник
обычно содержит до 1000 клеток, пригодных для наблюдения. Поскольку различные
бутоны в одном соцветии содержат микроспоры в последовательных фазах развития,
то при одной экспозиции можно обработать клетки на различных стадиях.
2.2 Действие кислорода. Кислородный
эффект
Кислород, находящийся в среде, может значительно усилить действие облучения. При удалении кислорода чувствительность к облучению уменьшается в два-три раза. Это так называемый кислородный эффект, и его, по-видимому определяют клеточные мембраны.
Фетнер в 1956 году изучал на микроспорах традесканции влияние кислорода на возникновение делеций и перекомбинаций фрагментов (дицентрические и трицентрические хромосомы, центрические кольца). При облучении дозами 200 и 400 рентген наблюдалось увеличение процента как делеций, так и обменов. Автор считает, что в отсутствие кислорода происходит меньше разрывов, а возникшие фрагменты реже перекомбинируются [17].
В опытах Джайлса и его сотрудников на микроспорах традесканции было обнаружено следующее:
) наличие кислорода приводит к увеличению числа хромосомных перестроек всех типов, другие газы влияния не оказывают;
) кислород эффективен лишь в том случае, когда он присутствует в клетке во время облучения. Введение его до и непосредственно после облучения никакого эффекта не дает. Кислород без облучения также не эффективен (хотя в литературе имеются данные, говорящие о возникновении хромосомных перестроек в хромосомах пыльцевых зерен при действии одного кислорода;
) даже при полном отсутствии кислорода (поскольку таковое может быть достигнуто в условиях опыта) наблюдается значительное количество перестроек.
.3 Факторы среды и другие неучтенные
факторы
В ходе мейоза возможны различные нарушения, причиной которых могут быть окружающие условия или генетические особенности организмов. У растений нарушения мейоза чаще всего возникают при изменение температуры. После изучения механизма действия температуры на формирование аберраций стало ясно, что повышение температуры, как и понижение, приводит к изменению интенсивности всех физиологических процессов клетки. Очевидно, в каждом конкретном случае температурный эффект может быть различным. Есть данные , что частота аберраций у микроспор традесканции увеличивается в 4 раза при облучение их рентгеновскими лучами в условиях пониженной температуры.
Нарушения мейоза у растений могут быть вызваны и заболеваниями. Например, у растений желтого люпина, больных узколистностью ( вирусное заболевание ), отмечено появление унивалентов, отстающих хромосом и анафазных мостов. В такие же нарушения в мейозе могут возникнуть при голодании и недостатке воды в почве.
У некоторых растений нарушения в мейозе ежегодно встречаются в больших количествах. Так, у Anemona nemorosa микроспорогенез всегда происходит при очень низкой температуре (около 0 °С) и поэтому во многих микроспороцитах в ходе мейоза имеются нарушения. Нарушения мейоза у растений могут быть обусловлены не только погодными условиями, но и особенностями опыления.
В ходе процесса мейоза возможны отклонения и нарушения, которые могут быть связаны с цитогенетическими и физиологическими особенностями организмов, а также с внешними условиями. Некоторые авторы отмечают, что частота нарушений в мейозе зависит не только от температурных условий, в которых произрастают растения, но и от особенностей сорта и от их урожайности.
Некоторые отклонения от общей схемы мейоза стали нормой для ряда видов растений. Хорошо известно, что в ходе микроспорогенеза у цветковых растений, как правило, почти все микроспороциты в норме проходят мейоз, и все 4 продукта мейоза являются функционально нормальными, то есть образуют мужской гаметофит. Однако из этого правила есть исключения. У представителей некоторых родов растений (Swertia, Holoptelia, Ophiopogon, Zostera) многие потенциальные микроспороциты не проходят мейоз, а дегенерируют, по-видимому, выполняя трофическую роль, так как в пыльниках этих растений слабо развит тапетум. В этих случаях часть спорогенных клеток компенсируют недостаточность функционирования тапетума. Иногда, как у Kigelia, дегенерация происходит на стадии тетрад микроспор.
Таким образом, изучение мейоза, особенно при
исследовании природных популяций растений ограничено тем, что он чувствителен к
неблагоприятным климатическим факторам, среди которых основную роль играют
недостаток влаги или ее быстрое испарение и повышенная температура.
2.4 Микроспорогенез как показатель в
оценке действия загрязнителей среды
Анализ литературных данных показал, что микроспорогенез растений является распространенным методом биоиндикации загрязняющего воздействия среды промышленными отходами и выбросами. В качестве тест-объектов используются различные растения, но наиболее чувствительными являются Tradescantia sp. , Acer platanoides L. , Vicia cracca L., Vicia faba.