Маркеры оксидативного стресса в прогнозировании резорбции костной ткани на модели генерализованного остеопороза
Раджкумар Д.С.Р., Файтельсон А.В., Артюшкова Е.Б., Фурман Ю.В., Чеботарев С.Н.
Исходя из современных сведений о патогенезе генерализованного остеопороза становится актуальным применение разнообразных методов исследования, включая биохимические, для ранней диагностики потери костной массы. Ни для кого не секрет, что при окислительном (оксидативном) стрессе усиливаются процессы резорбции костной ткани, маркерами которой служат показатели содержания окислительно-модифицированных белков, а некоторые из них являются биохимически обоснованными достоверными признаками развития остеопоротических нарушений. Цель исследования - оценить количественное содержание кетон-динитрофинилгидрозона в сыворотке крови при моделированном остеопорозе в качестве маркера резорбции костной ткани.
Все экспериментальные исследования выполнялись на самках белых крыс линии Wistar. Генерализованный остеопороз моделировался путем двусторонней овариэктомии. Для подтверждения выдвинутой гипотезы были использованы следующие исследования: цифровая рентгеновская денситометрия, гистоморфометрия костного биоматериала, а для определения степени тяжести оксидативного стресса измеряли значения общих и нейтральных кетон-динитрофинилгидрозонов в сыворотке крови. Результаты, полученные в ходе эксперимента, доказывают, что после овариэктомии у подопытных животных развиваются остеопоротические нарушения, заключающиеся в снижении минеральной плотности костной ткани в проксимальных метафизах плеч и бедер и в истончении ширины костных балок в этих локализациях, которые сопровождаются развитием оксидативного стресса. Анализ полученных результатов выявил корреляционную связь вышеуказанных показателей в норме и на модели патологии.
Ключевые слова: кетон-динитрофинилгидрозоны, овариэктомия, оксидативный стресс, остеопороз, резорбция.
Markers of oxidative stress in predicting bone resorption in a model of generalized osteoporosis
Rajkumar D.S.R., Faitelson A.V., Artyushkova E.B., Furman Yu.V, Chebotarev S.N.
Based on current information on the pathogenesis of generalized osteoporosis, it becomes relevant to use a va-riety of research methods, including biochemical ones, for the early diagnosis of bone loss. It is known that under oxidative stress, the processes of bone tissue resorption are enhanced, the markers of the latter are indicators of oxidative-ly modified proteins. It can be assumed that some of them are biochemically substantiated as reliable signs of the de-velopment of osteoporotic disorders. Aim - evaluation of the possibility of using ketone- dinitrophinylhydrozone as a marker of bone resorption in experimental hypoestrogen-induced osteoporosis. All experiments in this research work were carried out on female Wistar white rats.
Osteoporosis was modeled by bilateral oophorectomy. To confirm the hypothesis put forward, the following studies were used: digital radiological densitometry, histomorphometry of bone biomaterial, and to determine the severity of oxidative stress, the values of total and neutral ketone-dinitrophinylhydrozone were biochemically measured. Evidence has been obtained that, after oophorectomy, osteoporotic disorders develop in experi-mental animals, consisting of decrease in bone mineral density in the proximal metaphyses of the humerus and femur and thinning of the width of the bone trabeculae in these localizations, which are accompanied by the development of the oxidative stress phenomenon. The analysis of the results obtained revealed a correlation between the above indica-tors in the norm and on the pathology model.
Keywords: ketone-dinitrophinylhydrozone, oophorectomy, oxidative stress, osteoporosis, resorption.
Остеопороз чаще всего является возрастным расстройством костного ремоделирования, при котором процессы резорбции костной ткани превалируют над процессами костеобразования. Данное явление происходит вследствие уменьшения количества остеобластов и торможения их активности одновременно с экспрессией остеокластной деятельности, что ведет к увеличению хрупкости костей и повышенному риску возникновения низкоэнергетических переломов [1, 2].
С ростом продолжительности существования биологического субъекта (в том числе человека) наблюдаются повышение прооксидантных и ингибирование активности антиоксидантных агентов. Избыточное накопление прооксидантных веществ и снижение эндогенных антиоксидантов приводит к развитию оксидативного (окислительного) стресса, следствием которого является чрезмерная продукция свободных радикалов (СР) и активных форм кислорода (АФК), вызывающая окислительное повреждение биомолекул [3, 4]. Наряду с этим активные формы кислорода являются стимуляторами клеточного апоптоза, а большая их концентрация способствует угнетению активности и дифференцировки остеобластов, что ведет к экспрессии остеокластогенеза, то есть к усилению резорбции костной ткани [5].
Под воздействием АФК в тканях протекают два события: фрагментация белка, а на более поздних сроках - его агрегация. Маркером фрагментации белковых структур в биологических жидкостях является альдегид-динитрофенилгидрозон (АДНФГ), а признаком агрегации белка служит кетон-динитрофинилгидрозон (КДНФГ). Следовательно, количественные показатели окислительно-модифицированных белков представляют собой наиболее ранние признаки поражения различных органов при заболеваниях, индуцированных свободными радикалами кислорода. По их количественному соотношению можно судить о степени онтогенеза окислительного стресса в организме и прогнозировать формирование различных патологических состояний, в том числе организацию резорбтивных процессов в костной ткани [3].
С учетом накопленных сведений о течении генерализованного остеопороза становится актуальным применение разнообразных методов исследования, включая биохимические, для ранней диагностики потери костной массы, позволяющих осуществить своевременную профилактику. Можно предположить, что дефиниции окислительно-модифицированных белков в биологических жидкостях, особенно методом определения кетон-динитрофинилгидрозонов, наиболее информативны.
Цель исследования - оценить количественное содержание кетон-динитрофинилгидрозона в сыворотке крови при моделированном остеопорозе в качестве маркера резорбции костной ткани.
Материалы и методы исследования
Исследования производились на 60 самках белых крыс линии Wistar массой 250±30 г. Все хирургические вмешательства выполнялись под наркозом путем внутрибрюшинного введения раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. У 30 крыс формирование системных остеопоротических нарушений осуществлялось путем двусторонней овариэктомии. Животным (n=30) контрольной группы была проведена операция - лапаротомия без удаления яичников (ложная овариэктомия) [1].
После выполнения этих хирургических манипуляций с целью подтверждения развития остеопоротических нарушений через 8 недель прижизненно проводилась денситометрия проксимальных метафизов бедер и плеч для расчета минеральной плотности костной ткани (МПКТ), а после выведения животных из эксперимента - гистоморфометрия.
При цифровой рентгеновской денситометрии плечевых и бедренных костей определялась МПКТ с помощью мультифункциональной лабораторной рентгеновской установки In-Vivo FX Pro производства компании Bruker (США) с системой молекулярной визуализации при помощи лицензированного программного обеспечения - BoneDensitySoftware (рис 1).
Рис. 1. Мультифункциональная лабораторная рентгеновская установка In-Vivo FX Pro
При этом значения МПКТ выражались в граммах на кубические сантиметры (г/см3). Полученные результаты подвергались математическому анализу, при этом устанавливались отдельные средние показатели плотности костной ткани для плечевых и бедренных костей.
Для гистологической оценки формирования системных остеопоротических нарушений в изучаемых локализациях выполнялась световая микроскопия. Забор костного биоматериала проводился после эвтаназии животных. Материал закрепляли в 10%-ном растворе формалина с последующей проводкой, заливкой в парафине и окраской гематоксилин-эозином. Все предметные стекла с гистологическими препаратами осматривались под микроскопом Le^ CME, делались фотографии костных балок цифровым фотоаппаратом Olympus SP-350. Для осуществления гистоморфометрии костной ткани применяли программу ImаgeJ версии 1.391.43, а полученные значения выражали в микрометрах (мкм) [1, 6] (рис. 2).
Рис. 2. Измерение ширины костной трабекулы при гистоморфометрии в проксимальном метафизе бедра у крысы (окр. Г-Э, х200)
Для определения степени тяжести оксидативного стресса, индуцированного свободными радикалами кислорода, в настоящее время в биохимии применяются методы измерения показателей количества окислительно-модифицированных белков (ОМБ). Однако существующие способы [7] имеют некоторые недостатки: длительное по времени проведения исследование, что связано со значительным количеством этапов, а применяемый для растворения реактив - 8 М раствор мочевины - быстро кристаллизуется в воздушной среде, что приводит к существенным ошибкам при реализации анализа спектрофотометрическим методом.
Для ускорения данного биохимического исследования и улучшения качества выполнения анализа спектрофотометрическим методом в лаборатории НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета разработан и внедрен способ определения окислительно-модифицированных белков в биологических жидкостях [8]. Способ заключается в том, что биологическую жидкость (кровь) помещают в центрифужную пробирку, при этом находящиеся в ней окислительно- модифицированные белки окрашивают 2,4-динитрофенил-гидрозином. Образцы выдерживают при температуре 18-20°С в течение 60 минут, а затем белки осаждают 20%-ной трихлоруксусной кислотой, а извлеченный осадок растворяют в 2,0 мл 2%-ного раствора едкого натрия. Цифровые значения окислительно-модифицированных белков определяют спектрофотометрическим способом в диапазоне длин волн 230-530 нм. При этом полученные показатели общих (КДНФГо) и нейтральных кетон-динитрофинилгидрозонов (КДНФГн) устанавливают по величине площади графика поглощения в соответствующих диапазонах длин волн и рассчитывают в оптических единицах (ОЕ).
В ходе эксперимента подопытные животные содержались в стандартных условиях: в биологически чистом помещении с приточно-вытяжной вентиляцией с фильтрами тонкой очистки воздуха, с температурой в комнате 20-24°C и относительной влажностью в диапазоне от 45% до 65%, а цикл освещения был равен продолжительности светлых и темных периодов.
Все грызуны получали сухой гранулированный полнорационный корм и фильтрованную водопроводную воду. Физико-химические показатели корма полностью соответствовали ГОСТ Р 55453-2013.
Смена подстилки в клетках производилась ежедневно, в качестве наполнителя использовались очищенные от пыли древесные опилки, распределяемые равномерным слоем толщиной в 2 см.
Все подопытные животные, на которых проводились исследования, были рассортированы по отдельным группам методом стратифицированной рандомизации с учетом массы тела, условий содержания и питания, а также в соответствии с выполняемыми хирургическими манипуляциями.
Статистический анализ полученных данных осуществлялся в программе Microsoft Excel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. Оценка статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях производилась по «двухвыборочному t-тесту с различными дисперсиями» Стьюдента для независимых групп. Данный тест позволяет выявить достоверные различия между средними значениями из двух выборок с неравными дисперсиями и до сих пор чаще всего применяется в биомедицинских исследованиях в тех случаях, когда сравниваются выборки с нормальным распределением признаков. Проверку нормальности распределения признаков проводили путем расчета асимметрии и эксцесса.
Исследование проводилось по всем правилам и стандартам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708 н), а также по международным рекомендациям и правилам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986 г.).
Результаты исследования. При рентгеновской денситометрии было обнаружено, что средний показатель минеральной плотности костной ткани в проксимальных метафизах бедер у крыс после билатеральной овариэктомии составил 2,332 г/см3, то есть на 10% меньше аналогичного значения у ложнооперированных животных (2,584 г/см3). В проксимальных метафизарных зонах плечевых костей крыс МПКТ после овариэктомии была равна 2,007 г/см3, что на 9,9% меньше, чем у ложнооперированных животных (2,208 г/см3). Данные значения в обеих группах крыс имеют достоверные различия (p<0,05).
При гистоморфометрии было установлено, что у животных контрольный группы средняя ширина трабекул спонгиозной кости в вертельных отделах бедер составила 69,01±0,68 мкм, в то же время у крыс с моделированным остеопорозом это значение снижается на 25% (51,69±0,7 мкм). Оценка достоверности различия средних значений по группам (t-критерий Стьюдента) больше 2,77 (р=0,01). В проксимальных метафизах плечевых костей этот параметр составил у ложнооперированных животных 69,31±0,42 мкм, а у животных с экспериментальным остеопорозом - 51,38±0,73 мкм, то есть на 26% меньше по сравнению с крысами без остеопороза (рассмотрены средние значения по группам, t-критерий Стьюдента больше 2,771 (р=0,01)).