Материал: Культивування Clostridium tetani для одержання правцевого анатоксину

Стерилізують у автоклаві при 112 °С, 30 хв, тиск 0,05 МПа.

ДР 2.2.2. Приготування та стерилізація композиції Б. На технічних вагах зважують 0,2 г калій дигідрофосфату та 2,1 г динатрію гідрофосфату, Вносять у колбу на 300 мл, заливають 150 мл дистильованої води. (від ДР 1.1). Закривають колбу ватно-марлевою пробкою.

Стерилізують у автоклаві при 131°С, 60 хв, за тиску 0,15 МПа.

ДР 2.3. Приготування та стерилізація середовища для виробничого біосинтезу.

При коефіцієнті заповнення 0,8 робочий об’єм становитиме 4 л.

Готуючи поживне середовище заданого об’єму необхідно врахувати, що додають 10% посівного матеріалу, відповдно, кількість води для приготування поживного середовища буде складати 3,6 л.

Для композиції А кількість води буде становити 2,2 л, а для композиції Б - 1,4 л.

Вміст компонентів для приготування поживного середовища виробничого біосинтезу наведений в табл. 4.2.

ДР 2.3.1. Приготування та стерилізація композиції А. Відміряють у мірному циліндрі 20 мл гідролізату висівок (від ДР 2.1). На технічних вагах зважують 8 г триптону та 20 г дріжджового екстракту. Переносять у колбу на 3 л, заливають 2 л дистильованої води, закривають ватно-марлевою пробкою. Кип’ятять 10 хв на водяній бані. Фільтрують через тканинний фільтр.

Стерилізують у автоклаві при 112 °С, 30 хв, тиск 0,05 МПа (до ТП 4.1).

Таблиця 4.2

Розрахунок вмісту компонентів для приготування 4 л середовища

ДР 2.3.2. Приготування та стерилізація композиції Б. На технічних вагах зважують 1,8 г калій дигідрофосфату та 21,4 г динатрію гідрофосфату, Вносять у колбу на 2 л, заливають 1,5 л дистильованої води. Для запобігання утворення осаду доводять рН середовища до значення 4,5-5,5 соляною кислотою (від ДР 1.1). Закривають колбу ватно-марлевою пробкою.

Стерилізують у автоклаві при 131°С, 60 хв, за тиску 0,15 МПа (до ТП 4.1).

ТП 3. Підготовка посівного матеріалу

ТП 3.1. Підтримання колекційної культури

Колекційну культуру Clostridium tetani штам Копенгаген 471 зберігають у ліофілізованому стані при 4-8 °С.

ТП 3.2. Одержання робочої культури на агаризованих поживних середовищах на чашка Петрі

Культуру клітин (від ТП 3.1) висівають штрихом на чашку Петрі із кров’яним або печінковим агаром до ізольваних колоній. Вирощують без доступу кисню в анаеростаті 24-28 год при 34 °С.

ТП 3.3. Вирощування культури у рідкому поживному середовищі у пробірках

Отримані ізольовані колонії на чашках Петрі (від ТП 3.2) в асептичних умовах пересівають петлею в пробірки із середовищем Кітта-Тароцци, у розрахунку одна ізольована колонія для засіву однієї пробірки. Вирощуємо упродовж 24 годин в анаеростаті, який поміщений в термостат за температури 34 ^оС.

ТП 3.4. Вирощування культури в колбі на магнітному перемішувачі

Для вирощування рідкого посівного матеріалу у колбах на магнітному перемішувачі приготовлені та простерилізовані композиції А і Б (від ДР 2.2.1, ДР 2.2.2) асептично вносять у стерильну колбу на 500 мл. В стерильних умовах вносять посівну культуру (від ТП 3.3) Анаеробні умови у колбі забезпечуються великим коефіцієнтом заповнення. Колбу встановлюють на магнітному перемішувачі, вирощують 24 год при 34 ^оС, за повільного перемішування.

ТП 4. Біосинтез

ТП 4.1. Виробниче культивування

У одноразову ємкість ферментера вносять простерилізовані композиції А та Б (від ДР 2.3.1, ДР 2.3.2). рН середовища доводять до значення 7,4-7,6 за допомогою титрувальних розчинів (від ДР 1.1, ДР 1.2). Стерильно вносять інокулят (від ТП 3.4).

Виробничий біосинтез триває 168-216 год при температурі 34 ^оС, рН 7,4-7,6, при постійній подачі інертного газу.

По закінченню часу біосинтезу культуральна рідина поступає на стадію одержання анатоксину.

РОЗДІЛ 5. КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА ПРАВЦЕВОГО ТОКСИНУ

Упродовж культивування періодично (кожних 8 години) відбирають проби культуральної рідини для мікробіологічного контролю, визначення концентрації біомаси, а також вмісту джерела вуглецю і амінного азоту.

5.1 Мікробіологічний контроль

Мікробіологічний контроль здійснюється розсівом на чашки Петрі з агаризованими середовищами і мікроскопуванням. Культуральну рідину розсівають петлею до ізольованих колоній на чашки Петрі з м'ясо-пептонним агаром (МПА) для виявлення бактерій, з сусло-агаром (СА) або глюкозо-картопляним агаром (ГКА) - для виявлення дріжджів і грибів.

Специфіка роботи з правцевим токсином полягає в небезпечності цього процесу, тому людина буде працювати за допомогою ламінарного бокса, який надасть спеціалісту повну безпеку під час роботи (рис. 5.1.1.) [13].

Рис. 5.1.1. Ламінарний бокс "Ламинар-С"-"Protect"

Оскільки технологічний процесс повинен бути стерильним, то пробу культуральної рідини відбирають в строго асептичних умовах.

Для мікроскопування використовують препарати «роздавлена крапля».

Препарат «роздавлена крапля» готують на знежиреному предметному склі, на яке наносять маленьку краплю культуральної рідини, накривають накривним скельцем і розглядають з об'єктивом 40х, а також мікроскопують препарат з імерсійною системою..tetani - велика (3-12 × 0,3-0,6 мікрон), рухома за допомогою кількох джгутиків (перитрих) паличкоподібна бактерія. Утворює овальні ендоспори, що перевищують діаметр клітини в 2-3 рази, розташовані термінально (характерна морфологія типу «барабанних паличок» (рис. 5.1.2.) [7].

Рис. 5.1.1. Clostridium tetani у світловому мікроскопі при збільшенні 90х

5.2 Контроль показників росту і синтезу

.2.1 Визначення концентрації біомаси

Біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії (непрямий метод) з наступним перерахунком на суху біомасу за допомогою калібрувального графіка.

5.2.2 Визначення концентрації цільового продукту (правцевого токсину)

Підготовка проби: Необхідна проба виготовляються з тетаноспазміну, який піддається обробці 0,3-0,4%-м розчином формаліну і витримуванню при температурі 38-40 °С протягом 3-4 тижнів).

Визначення: Виходячи з передбачуваної активності, пробу розводять 0,9% розчином натрію хлориду до концентрації 0,1 МО/мл. Готують кілька розведень, що відрізняються за активністю одне від іншого на 10-20%.

По 1 мл кожного розведення сироватки переносять у флакони, додають по 2 мл 0,9% розчину натрію хлориду і 10 досліджуваних доз правцевого токсину в обсязі 1 мл. Отримані суміші обережно перемішують, уникаючи піноутворення, і після витримування при температурі (37 ± 1) ºС протягом (45 ± 1) хв вводять 4 білим мишам масою (17 ± 1) г під шкіру стегна в об'ємі 0,4 мл.

Дослід супроводжують контролем дослідної дози токсину, для чого готують суміш, що містить 1 мл стандартного зразка активності протиправцевої сироватки, розведеного до концентрації 0,1 МО / мл, 1 мл токсину, що містить 10 дослідних доз, і 2 мл 0,9% розчину натрію хлориду . Суміш інкубують при тих же умовах, що і випробувану сироватку і вводять її 4 білим мишам масою (17 ± 1) г під шкіру стегна в об'ємі 0,4 мл. За тваринами дослідної та контрольної груп спостерігають 4 доби, відзначаючи кількість загиблих від правця.

Специфічну активність (титр) сироватки розраховують, виходячи з найбільшого її розведення, яке в суміші з дослідною дозою токсину забезпечує захист 100% мишей від правця. Тест не враховують, якщо всі миші в контрольній групі залишилися живі без ознак правця.

Питома активність. Не менше 1000 МО на 0,1 г білка. Питому активність (Х) обчислюють за формулою:

X = T / (C × 10),

де:

Т - титр сироватки, МО / мл;

С - концентрація білка, г / мл;

- постійний коефіцієнт [11].

5.2.3 Визначення концентрації амінного азоту

Визначення проводять мідним способом. Суть даного методу полягає у тому, що визначається кількість амінокислот у певній кількості досліджуваного розчину, при додаванні фосфорнокислої міді у боратному буфері та відтитровуванні йоду розчином тіосульфату натрію. Визначається за різницею кількості розчину тіосульфату натрію витраченого на титрування дослідного зразка та контролю.

Техніка визначення:

мл супернатанту культуральної рідини наливають у мірну колбу на 25 мл і додають одну - дві краплі тимолфталеїну і по краплях 1 н. розчин гідроксиду натрію до блідо-синього забарвлення. Після цього у колбу додають 10 - 15 мл суспензії ортофосфату міді у боратному буфері, потім доводять вміст колби до мітки дистилоьваню водою. Добре збовтують і фільтрують через складчастий фільтр з малопористого фільтрувального паперу або центрифугують.

Фільтрат повинен бути зовсім прозорий, бо за наявності частинок осаду завищується кінцевий результат.

- 10 мл фільтрату відбирають у конічну колбу або у фарфорову чашку, додають 0,25 - 0,5 мл 80% оцтової кислоти, 0,2 - 0,4 г калій йодиду. Йод, що виділився, відтитровують 0,01 н. розчином тіосульфату натрію, додаючи в кінці титрування 1 - 4 краплі крохмалю до зникнення синього забарвлення. Параллельно проводять контрольний дослід, де замість досліджуваного досліду беруть дистильовану воду.

Результат обчислюють за формулою:

Х = ,

де Х - вміст амінного азоту, мг/л; а - кількість 0,01 н. розчину тіосульфату натрію, витрачена на титрування дослідного зразка, мл; в - кількість 0,01н. розчину тіосульфату натрію, витрачена на титрування контролю,мл; n - кількість досліджуваного розчину, яку взято на аналіз, мл[15].

5.2.4 Визначення вмісту вуглеводів прискореним методом Шоорло

Метод Шоорло застосовують для аналізу розчинів редукуючи цукрів з низьким вмістом сахарози або якщо необхідно визначити загальний вміст цукрів у перерахунку на сахарозу.

У конічну колбу місткістю 50 см³ вносять піпеткою 3 см³ супернатанту культуральної рідини, додають піпеткою або бюреткою точно 1 см³ 7%-го розчину сульфату міді (II) і 1 см³ лужного розчину сегнетової солі, протягом 2 хв доводять суміш до кипіння, кип'ятять рівно 2 хв, швидко охолоджують до кімнатної температури, додають 1 см³ 30%-го розчину йодиду калію, 1см³ 25%-ї сірчаної кислоти і відразу ж титрують 0,1 н. розчином тіосульфату натрію до світло-жовтого забарвлення. Потім додають 3-4 краплі 1%-го розчину крохмалю (індикатор) і продовжують титрування до зникнення синього забарвлення.

Проведення контрольного досліду: Аналогічно проводять контрольний дослід, в якому замість 3 см³ досліджуваного розчину беруть ту ж кількість дистильованої води.

Різниця між величинами, отриманими в контрольному досліді і при визначенні цукру в досліджуваному розчині, помножена на поправку до титру тіосульфату натрію, показує кількість відновленої міді, виражене в см³ точно 0,1 н. розчину тіосульфату натрію. Для перерахунку кількості 0,1 н. розчину тіосульфату натрію, що відповідає кількості відновленої міді, на цукор (мг сахарози) користуються такими коефіцієнтами, встановленими експериментальним шляхом: глюкоза - 3,3; фруктоза - 3,7; сахароза - 3,4; мальтоза - 5,4. Найбільш точні показники виходять у тому випадку, якщо різниця результатів титрування 0,1 н. розчином тіосульфату натрію в контрольному і основному дослідах знаходиться в межах 0,7-1,2 см³. При використанні витяжок з більш високим вмістом цукру для визначення беруть 1 см³ витяжки і додають 2 см³ дистильованої води [16].

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1.      Векірчик К. М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. - К.: Либідь, 2001. - 312 с.

.        Пяткин К.Д. Микробиология с вирусологией и иммунологией. - М.: «Медицина», 1971. - 243-246 с.

3.      Фармацевтична енциклопедія: Анатоксин. [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://www.pharmencyclopedia.com.ua/article/2779/anatoksin>

.        Краснопольский Ю.М., Борщевская М. И. Биотехнология иммунологических препаратов - Харьков: Фармитэк, 2008.-312 с.

.        Веб-аптека: анатоксин столбнячий. Описание препарата. Инструкция по применению. [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://www.webapteka.ru/drugbase/name8249.html>.

.        Кашпур Н.В., Волянська Н.П., Чернявский В.И. Некоторые механизмы формольной детоксикации столбнячего токсина - Харьков, 2009

.        Клостридии столбняка и столбняк . [Електронний ресурс]: Режим доступу         <http://vse-zabolevaniya.ru/mikrobiologija/klostridii-stolbnjaka-stolbnjak.html>

.        Биология и медицина. [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://medbiol.ru/medbiol/microbiol/0000589b.htm>

.        Культуральные свойства возбудителя столбняка. Антигенная структура столбняка. Биохимические свойства столбняка. [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://meduniver.com/Medical/Microbiology/421.html>

.        Clostridium tetani Growth and Toxin Production in the. Intestines of Germfree Rats/ Departments of Surgery and Medical Microbiology, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin S3706

.        Биологическая опасность и уровни биологической безопасности. [Електронний ресурс]:Режим доступу <http://laborant.net/specialist/publications/lamboxarticle/83/>

.        Лабораторный биореактор CelliGen BLU. [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://labinstruments.su/equipment/bioreaktory-i-fermentery-celligen-blu>

.        Ламинарный бокс класс II, тип А2 "БМБ- II-Ламинар-С-1,2" . [Електронний ресурс]: Режим доступу <http://veresk-med.ru/bav-laminar-s-protect-310180.html>

.        Сыворотка противостолбнячная ФС. [Електронний ресурс]:Режим доступу <http://www.rosminzdrav.ru/documents/7992-rasporyazhenie-pravitelstva-rf-1344-r-ot-21-oktyabrya-2004-g>

.        Буценко Л.М., Красінько В.О. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Лабор. Практикум - К.:НУХТ,2011. - 82с.

.        Методи контролю харчових виробництв/Мельник С.Р.,Мельник Ю.Р - Львів; Національний університет «Львівська політехніка», 2005. - 26с.