Материал: Культивування Clostridium tetani для одержання правцевого анатоксину

Культивування Clostridium tetani для одержання правцевого анатоксину

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

Кафедра біотехнології і мікробіології

КУРСОВА РОБОТА

з дисципліни «Технологія мікробного синтезу лікарських засобів»

на тему: «Культивування Clostridium tetani для одержання правцевого анатоксину»

Студентки 3 курсу 3 групи

напряму підготовки 6.051401

«Біотехнологія»

Расулової Є.Р.

Керівник:

доц., к.т.н.

Красінько В.О.

Київ 2015

РЕФЕРАТ

Курсова робота присвячена розробленню технологічної схеми біосинтезу правцевого анатоксину з використанням бактерії Clostridium tetani.

В ході роботи було обґрунтовано:

) вибір біологічного агенту, штам бактерії C.tetani Копенгаген 471, який дає змогу отримати більшу концетрацію тетаноспазміну в порівнянні з іншими штамами, які використовуються у виробництві (Колле 154, 473, тощо).

) вибір поживного середовища, а саме казеїново-рослинного, яке дозволить бактерії C.tetani Копенгаген 471 продукувать концентрацію тетаноспазміну до 26 ОЗ/мл. Наведено склад поживного середовища для культивування даного мікроорганізму. З урахуванням складу поживного середовища запропоновано схему його підготовки та підібрано режими стерилізації його компонентів.

) вибір ферментаційного обладнання з урахуванням того, що проводиться культивування анаеробного патогенного мікроорганізму.

Технологічна схема біосинтезу анатоксину C.tetani Копенгаген 471 включає допоміжні роботи (приготування та стерилізація титрувальних агентів, а також підготовка і стерилізація поживного середовища) та власне технологічний процес (підготовка посівного матеріалу та виробничий біосинтез).

Курсова робота складається із вступу, п’яти розділів, списку використаної літератури та технологічної схеми (1 аркуш формату А-3). Загальний обсяг роботи - 34 сторінки, 5 таблиць та 3 рисунки.

Ключові слова: Clostridium tetani, правцевий токсин, казеїново-рослинне середовище

ЗМІСТ

культивування фермент правцевий токсин

РЕФЕРАТ

ВСТУП

РОЗДІЛ 1. Опис цільового продукту

РОЗДІЛ 2. Обгрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування

РОЗДІЛ 3. Обгрунтування способу культивування і типу ферментера для отримання правцевого токсину

РОЗДІЛ 4. Технологічна схема процесу біосинтезу правцевого анатоксину

РОЗДІЛ 5. Контроль виробництва правцевого токсину

.1 Мікробіологічний контроль

.2 Контроль показників росту і синтезу

.2.1 Визначення концентрації біомаси

.2.2 Визначення концентрації цільового продукту

.2.3 Визначення концетрації амінного азоту

.2.4 Визначення вмісту вуглеводів

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

ВСТУП

Вакцінологія вивчає методи штучного створення несприйнятливості до інфекційних агентів і принципи розробки нових вакцинних препаратів.

Вакцина (лат. vacca - корова) - препарат, що складається з ослаблених, вбитих збудників хвороб чи продуктів їхньої життєдіяльності. Ці специфічні речовини дістали назву від противіспяного препарату, виготовленого з вірусу коров'ячої віспи. Метод щеплень за допомогою вакцин називають вакцинацією, або імунізацією [1].

Творцем наукової теорії запобігання інфекційним захворюванням за допомогою виготовлених в лабораторії вакцин був засновник медичної мікробіології Луї Пастер. Вперше вакцинацію було здійснено в 1796 році англійським лікарем Едвардом Дженнером, який штучно прищепив дитині коров'ячу віспу, в результаті чого ця дитина набула імунітету до натуральної віспи [1].

Сьогодні, вакцинація населення в нашій державі є регулярною та частково обов’язковою. Оскільки, існують хвороби, яких можна уникнути лише завдяки попередній вакцинації, наприклад, коклюш, туберкульоз, поліомеліт та правець, то звичайно вакцинологія швидко розвивається та є необхідною для сьогодення.

Сучасні вакцини поділяють на чотири групи:

·        вакцини, які виготовляють із живих збудників з ослабленою вірулентністю

·        вакцини з убитих патогенних мікробів

·        анатоксини (виготовляються з екзотоксинів відповідних збудників обробкою їх 0,3-0,4%-м розчином формаліну і витримуванням при температурі 38-40 °С протягом 3-4 тижнів). Добуті у такий спосіб дифтерійний, правцевий, стафілококовий, холерний та інші анатоксини знайшли широке застосування в практиці;

·        хімічні вакцини (їх виготовляють не з цілих бактеріальних клітин, а із хімічних комплексів, добутих шляхом обробки суспензії клітин спеціальними методами; наприклад, для профілактики черевного тифу і правця застосовують хімічну сорбовану вакцину з О- і Vi- антигенів черевнотифозних бактерій і очищеного концентрованого правцевого анатоксину).

Багато мікроорганізмів, що викликають захворювання в людини, небезпечні тим, що виділяють екзотоксини, що є основними патогенетичними факторами захворювання (наприклад, дифтерія, правець).

Правець - це інфекційне захворювання <#"879449.files/image001.jpg">

Рис.3.1. Анаеростат на 15 чашок Петрі

Оптимальна температура росту 34-37 °С, отже, даний мікроорганізм є мезофілом.

Особливість культивування С.tetani є використання надзвичайно складних поживних середовищ, які вимагають великої кількості підготовчих робіт.

При виробництві правцевого токсину якість отриманого гідролізату казеїну визначає, як токсиноутворення, так і процес подальшого очищення. Необхідно враховувати, що кислотний гідроліз білкової сировини відбувається не тільки на стадії власне витримування реакційної суміші при заданій температурі, але і під час доведення її до даної температури, також при охолодженні отриманого гідролізату до температури, вказаної в технології. Так, при гідролізі казеїну 80% продуктів гідролізу накопичується на стадії нагрівання. Причому внесок стадій нагрівання та охолодження в даний процес зростає із збільшенням місткості апарату, що, природно, вимагає проведення валідації процесу при масштабуванні.

Для приготування гідролізата висівок використовують пшеничні висівки крупного помелу (вологість - 11-13%, крохмалю 23-30%), які поміщають в очищену воду в співвідношенні 1: 6, додають 1% хлороформу і для проведення гідролізата поміщають при 45°С на 15 годин при періодичному помішуванні. До 4 об'ємів казеїнового гідролізату додають 1 об'єм гідролізата висівок. Суміш розводять водою до амінного азоту - 130-150 мг, доводять до кипіння, додають 0,05% динатрій гідрофосфату і 0,05% дигідрофосфату калію, встановлюють pH 7,4-7,6 і кип'ятять ще 10 хв.

Середовище фільтрують і стерилізують при 110-112°С протягом 30 хв. Для збереження ростових властивостей поживного середовища можна використовувати метод мембранної фільтрації.

Концентрація пептону в середовищі становить 1,5-1,7%, амінного азоту 130-150 мг, що дозволяє забезпечити бактерії правця джерелом азоту, який необхідний культурі мікроорганізмів для життєдіяльності. До складу середовища в якості джерела вуглецю вводиться 0,5% глюкози (розчин вводиться в середовище стерильним), яка використовується мікроорганізмами як джерело енергії. Продукти гідролізата висівок і вітаміни використовуються як фактори росту, які необхідні мікроорганізмам в малих дозах для синтезу біологічно активних речовин, що регулюють внутрішньоклітинний метаболізм. Джерелом фосфорного харчування є додаються в середу фосфати калію і натрію. Неорганічні солі служать не тільки джерелом іонів, необхідних для нормального функціонування клітин C. tetani, а й виконують буферну функцію, нівелюючи великі зміни pH в процесі росту мікроорганізмів [4].

Підготовчі стадії будуть представленні підготовкою титруючих агентів: NH₄OH (40%) та HCl (6%) для підтримання pH 7,4-7,6.

Специфіка полягає в тому, що культивується патогенно небезпечний мікроорганізм, спори стійкі до хімічних і фізичних дій, вони виживають протягом 8-10 год в 1 % розчині сулеми і 5 % розчині фенолу, а також витримують кип'ятіння протягом 0,5-1 год, тому це вимагає додаткових правил роботи з патогенними мікроорганізмами. Наприклад, персонал має бути захищеним (халат, маска, рукавички, захисні окуляри), робота повинна проводитися в спеціальних боксах або приміщеннях з обмеженою доступністю, не проводити піпетування ротом - використовувати відповідні механічні пристрої, а також інші відомі правила безпеки під час роботи з даним мікроорганізмом [11].

Для культивування даного мікроорганізму обираємо ферментер марки CelliGen BLU (рис.3.2), об’ємом на 5 л. Даний біореактор має змінні пластикові стерильні посудини одноразового використання із загальним обсягом 5 л і робочим об'ємом 1,25 - 3,75 л, магнітний привід (швидкість 25-200 об / хв.), можливість перемикання напрямку обертання для створення висхідного або низхідного потоку. Особливістю наведеного ферментеру є те, що використовуються одноразові посудини для культивування, це актуально в нашому випадку, бо культивується патогенний мікроорганізм [12].

Рис.3.2. Ферментер, для культивування С.tetani, з метою отримання правцевого токсину

Виробничий біосинтез здійснюємо у ферментері об’ємом 5 л з коефіцієнтом заповнення 0,8. Робочий об’єм ферментера (V_роб) визначаємо за формулою:

_роб = V_г.ф К_зап ,

де V_г.ф - геометричний об’єм ферментера;

К_зап - коефіцієнт заповнення, 0,8._роб = 5  0,8 = 4 л.

Кількість посівного матеріалу становить 10% від об’єму поживного середовища. Отже, для одержання 4 л культуральної рідини потрібно:_роб.1 = 4 0,1 = 0,4 л посівного матеріалу.

Таку кількість інокуляту можна одержати в колбі на 500 мл. з використанням магнітного перемішуючого пристрою.

Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу правцевого токсину у ферментері об’ємом 5 л з коефіцієнтом заповнення 0,8 буде проходити в один етап - вирощування в колбах з використанням магнітного перемішуючого пристрою.

Всі компоненти поживного середовища для вирощування бактерії С.tetani проходять стерилізацію, але з метою збереження поживних речовин у максимально придатному для споживання стані, процес стерилізації умовно поділяємо на такі композиції (залежно від режимів стерилізації):

Композиція А - триптон, гідролізат висівок, дріжджовий екстракт (112°С, 30 хв. при Р=0,05 МПа)

Композиція Б - калій дигідрофосфат, динатрій гідрофосфат (131°С, 60 хв. при Р=0,15 МПа).

РОЗДІЛ 4. ТЕХНОЛОГІЧНА СХЕМА ПРОЦЕСУ БІОСИНТЕЗУ ПРАВЦЕВОГО ТОКСИНУ

Технологічна схема доферментаційних процесів та процесу біосинтезу правцевого токсину представлено у графічній частині роботи.

Технологічний процес біосинтезу тетаноспазміну Clostridium tetani штам Копенгаген 471 складається із допоміжних і основних робіт. До стадій допоміжних робіт (ДР) належить: приготування розчину HCl та NaOH, підготовка і стерилізація поживного середовища. До основного технологічного процесу (ТП) відносять стадії приготування посівного матеріалу та виробничий біосинтез.

Креслення технологічної схеми представлене на 1 аркуші формату А3, де зображені допоміжні роботи та технологічний процес.

ОПИС ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ ПРОЦЕСУ БІОСИНТЕЗУ ПРАВЦЕВОГО ТОКСИНУ

Проведення допоміжних робіт (ДР):

ДР 1. Приготування титруючих розчинів

ДР 1.1. Приготування 6%-го розчину соляної кислоти

Для попередження реакцій залуження, а для підтримання оптимального рН при виробничому біосинтезі, у ферментер додають 6% розчин HCl з розрахунком 0,002 л на 1 л середовища. Таким чином, загальна потрібна кількість HCl:

´0,002 = 0,01 л = 10 мл

Такої кількості розчину сповна вистачить для контролю рН середовища при виробничому біосинтезі.

Для приготування 10 мл 6% р-ну соляної кислоти у колбі об’ємом 50 мл змішують ≈ 1,5 мл 38% соляної кислоти та ≈ 8,5 мл дистильованої води.

Готовий розчин не потребує стерилізації. Зберігається у тій же колбі.

ДР 1.2. Стерилізація 40%-го розчину гідроксиду амонію

Для підтримання оптимального рН на рівні 7,4-7,6 при виробничому біосинтезі, у ферментер додають 40% розчин NH₄OH з розрахунком 0,002 л на 1 л середовища. Таким чином, загальна потрібна кількість NH₄OH:

´0,002 = 0,01 л = 10 мл

Такої кількості розчину сповна вистачить для контролю рН середовища при виробничому біосинтезі.

Отже, 10 мл 40% NH₄OH вносять у колбу на 50 мл, фільтрують через мембранний фільтр так, щоб фільтрат опинявся у стерильній колбі на 50 мл. Зберігають у ній же.

ДР 2. Підготовка та стерилізація поживного середовища

ДР 2.1. Приготування гідролізату висівок. Для отримання гідролізату висівок використовують пшеничні висівки крупного помелу (вологість - 11-13%, крохмалю 23-30%). Зважаючи на невеликі об’єми, готуємо одразу ж і для основного ферментаційного процесу (всього 22 г). Співвідношення кількості висівок до води - 1:6. Зважують 25 г пшеничних висівок на технічних вагах та переносять у колбу на 300 мл, заливають 132 мл дистильованої води. Додають у колбу 1,32 мл (1%) хлороформу, який в свою чергу буде попереджати появу контамінації та з часом випарується, закривають ватно-марлевою пробкою. Поміщають у термостат, який поміщений під витяжною шафою, витримують 15 год при 45 °С та періодичному помішуванні.

ДР 2.2. Приготування та стерилізація середовища для вирощування посівного матеріалу в колбах на магнітному перемішувачі

Для вирощування інокуляту необхідно приготувати 400 мл поживного середовища. Джерело вуглецю - гідролізат висівок, фактори росту - гідролізат висівок та вітаміни, що містяться у дріжджовому екстракті, джерело фосфору - фосфати калію та натрію. Вміст компонентів для приготування 400 мл середовища наведені в табл. 4.1

Таблиця 4.1

Розрахунок вмісту компонентів для приготування 400 мл середовища

ДР 2.2.1. Приготування та стерилізація композиції А. Зважують на технічних вагах 0,8 г триптону та 2 г дріжджового екстракту. За допомогою мірного циліндра на 10 мл відміряють 2 мл гідролізату висівок (від ДР 2.1). Переносять компоненти у колбу на 500 мл, заливають 250 мл дистильованої води. Кип’ятять 10 хв на водяній бані, щоб прибрати розчинений кисень в поживному середовищі. Далі суміш фільтрують крізь тканинний фільтр. Закривають ватно-марлевою пробкою.