Материал: Конкуренция среди семи субъединиц Escherichia coli

При насыщении порядок кор-фермент-связанных субъединиц σ составлял σ⁷⁰ > σ^N > σ^F > σ^H/σ^FecI > σ^E > σ^S. В условиях насыщения σ доля холофермента Eσ⁷⁰ составляла ∼39% от общего количества холоферментов. Отсюда мы заключаем, что в условиях конкурентного связывания в присутствии всех семи субъединиц σ сродство σ⁷⁰ является самым сильным, а сродство σ^S-самым слабым. Судя по разнице сродства (>16 раз) в связывании кор-фермента между σ⁷⁰ и σ^S и значению K_d = 0,26 нм для σ⁷⁰ (см. выше), мы оцениваем, что кажущееся значение K_D для σ^S с кор-ферментом составляет ≈ 4,3 нм (табл.1).

σ subunit		Kd (nM)a	Core binding affinity	Intracellular concentrationb		Holoenzyme ratioc (%)
				(fmol/mg protein)	(molecules/cell)
σ70 (σD)		0.26	1.0	160	700	78
σ54 (σN)		0.30	1.55	25	110	8
σ38 (σS)		4.26	16.4	<1	<1	0
σ32	(σH)	1.24	4.75	2.1	<10	0
σ28	(σF)	0.74	2.85	85	370	14
σ24	(σE)	2.43	9.35	1.4	<10	0
σ18	(σFecI)	1.73	6.65	<1	<1	0

Переключение одной кор-фермент-связанной σ на другую σ-субъединицу

Исходя из сродства связывания каждой субъединицы σ, как указано выше, мы можем предсказать эффективность замены одной σ-субъединицы, связанной с кор-ферментом, другой σ-субъединицей. Здесь мы протестировали две крайние комбинации: (i) σ⁷⁰ и σ^H, которые имеют в 10 раз более низкое сродство связывания с кор-ферментом, чем σ⁷⁰; и (ii) σ⁷⁰ и σ^N, которые имеют сродство связывания с кор-ферментом вплоть до σ⁷⁰. Эквимолярную смесь кор-фермента (20 пмоль) и одной субъединицы σ (20 пмоль) инкубировали до равновесия и затем добавляли эквимолярное количество (20 пмоль) второй субъединицы σ. В различные моменты времени после добавления второй σ-субъединицы измеряли концентрацию σ-связанной с ферментом субъединицы. Результаты конкурентных экспериментов с σ⁷⁰ / σ^H показали, что: замещение связанного с ферментом σ⁷⁰ при добавлении σ^H было мало даже после 600-минутной инкубации (рис. 4А); связанный с кор-ферментом σ^H был быстро заменен на σ⁷⁰ в течение 10 минут (рис. 4В). С другой стороны, в конкурентном эксперименте между σ⁷⁰ и σ^N ≈30% σ70, свяязанного с кор-ферментом, было заменено добавленным σ^N (рис. 4C), в то время как по меньшей мере половина σ^N, связанного с кор-ферментом, оставалась связанной даже после длительной инкубации в течение 600 минут после добавления σ⁷⁰ (рис. 4D). Все эти результаты находятся в хорошем согласии с различиями в сродстве связывания кор-фермента между σ⁷⁰ и σ^H и между σ⁷⁰ и σ^N (рис. 3; см. также таблицу 1). Более того, небольшая разница в скорости замены σ между двумя комбинациями, Eσ⁷⁰ / Eσ^N (30% на рис. 4C) и Eσ^N / Eσ⁷⁰ (50% на рис. 4D), отражает небольшую разницу в сродстве связывания с кор-ферментом между σ⁷⁰ и σ^N (см. рис. 3).

Обсуждения

Различие в сродстве связывания с кор-ферментом среди семи субъединиц E.coli

Сравнение сродства связывания с кор-ферментом среди семи субъединиц σ из E.coli указывает на то, что субъединица σ⁷⁰ имеет наибольшее сродство с кор-ферментом для транскрипции генов роста и «домашнего хозяйства». Разница между сродством σ⁷⁰ (0,26 нМ) и σ^S (с самой слабой связывающей активностью (4,28 нМ)) была в 16 раз меньше (см. Таблицу 1). Эта оценка проводилась при таких условиях, что содержание функциональных молекул σ в отношении связывания с кор-ферментом было одинаковым для семи препаратов субъединиц σ. Однако, некоторые молекулы σ неактивны при связывании с кор-ферментом при проведении полного цикла транскрипции. Например, в случае субъединицы σ⁷⁰ содержание транскрипционно компетентных молекул составляло ~ 50%, что измерялось уровнем синтеза матричной РНК lacUV5 в однократном анализе транскрипции. Это значение полностью функциональной субъединицы σ⁷⁰ представляет собой минимум, потому что: (i) определенная доля комплексов инициации с Eσ⁷⁰ становится неудавшейся до выхода промотора (уровень неудачной инициации зависит от природы промотора) (см., например, 35); (ii) некоторые транскрипционно неактивные Eσ⁷⁰, как определено с помощью анализа транскрипции, направленной на промотор lacUV5, могут быть активными с промоторами, отличными от lacUV5. Точная оценка функциональных молекул более сложна для других σ-субъединиц, потому что доступные промоторы, распознаваемые этими σ-субъединицами, ограничены и мы не знаем соотношения продуктивной и абортивной инициации транскрипции in vitro, катализируемой каждым холоферментом. Однако мы позаботились о том, чтобы получить остальные шесть субъединиц σ в такой же активной форме, как и субъединица σ⁷⁰, используя те же процедуры для экспрессии и очистки белка, что и для субъединицы σ⁷⁰. В результате все используемые препараты были полностью активны в связывании с кор-ферментом.

Чистота семи субъединиц σ находилась в диапазоне от 90 до 98%, что определялось окрашиванием SYPRO Orange (SYPRO Orange - флуоресцентный краситель мероцианинового типа, который используется для окрашивания белка в процессе определения характеристик белка), которое столь же чувствительно, как окрашивание серебром. Загрязнение σ-препаратов анти-σ факторами Rsd (36), FlgM (37) и Rse (38,39) может привести к снижению концентрации функциональных молекул σ или интерференции взаимодействия с σ-ферментом. Однако иммуноблот-анализ (аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков) препаратов σ, использованных в этом исследовании, не дал никакого сигнала против антител, анти-Rsd и анти-FlgM (данные не представлены).

Определенное значение K_d (0,26 нМ) для σ⁷⁰ немного ниже, чем предыдущее (0,5–1,0 нМ) с использованием методов ВЭЖХ гель-фильтрации и флуоресценции (40). Разница может быть связана с различием в содержании функциональной субъединицы σ⁷⁰ и/или кор-фермента или в условиях анализа. Joo и соавторы (41) определили значение K_d 1 нМ для σ^H в эксперименте насыщения σ при транскрипции in vitro, а значение 100 нМ при центрифугировании в градиенте глицерина. Константы связывания, полученные посредством гель-фильтрации и центрифугирования в градиенте глицерина, должны быть ниже, чем полученные в анализах транскрипции, из-за эффекта разбавления при отделении связанной с кор-ферментом σ от несвязанной свободной σ. Таким образом, необходимы дальнейшие технические усовершенствования для точного определения сродства связывания каждой субъединицы σ для кор-фермента, но настоящее исследование обеспечивает относительный порядок сродства связывания кор-фермента среди семи σ-субъединиц E.coli. Настоящее исследование ясно показывает, что сродство σ^N-субъединицы к кор-ферменту так же высоко, как и у других σ-субъединиц. Таким образом, АТФ-зависимая реакция в образовании открытого комплекса Eσ^N-промотор может быть на стадии после связывания холофермента Eσ^N с промотором.

Структурная основа разницы в сродстве связывания с кор-ферментом между субъединицами σ

Семейство белков σ⁷⁰ имеет общую структурную организацию, за исключением σ⁵⁴, которая состоит из четырех консервативных доменов (4,5). Роль каждого домена в распознавании промотора была тщательно изучена с использованием генетического, химического и физического подходов (обзор см. 4). Однако, наши знания о роли σ-структурных доменов (последовательностях) в межбелковых взаимодействиях с кор-ферментом ограничены. Мы идентифицировали поверхности взаимодействия субъединиц σ⁷⁰, σ^N и σ^S на субъединицах кор-фермента после взаимодействия контактно-зависимых мест расщепления с тетраацетатом железа (S) -1- (п-бромацетамидобензил)этилендиамин (Fe-BABE) (42), связанным в различных позициях с σ-субъединицами (43–45). Результаты показали, что несколько мест вдоль этих σ-полипептидов вовлечены в контакт с β- и β’-субъединицами кор-фермента, большинство из которых расположены в консервативных местах (последовательностях) среди трех σ-субъединиц. Исследования на мутацию также показали, что субъединица σ⁷⁰ содержит множественные поверхности взаимодействия с кор-ферментом (46) и, кроме того, одни и те же области и даже эквивалентные аминокислотные остатки, как в σ⁷⁰, так и σ^H, участвуют в связывании кор-фермента. Если основные поверхности для межбелковых контактов с кор-ферментом одни и те же в семействе белков, то различия в сродстве связывания кор-фермента, наблюдаемые в этом исследовании, могут объясняться различиями в количестве поверхностей контакта или остатков контактной аминокислоты или в сродстве второстепенных поверхностей, характерных для каждой субъединицы. Эксперименты по контакт-зависимому расщеплению белка с FeBABE действительно указали на присутствие небольшого количества уникальных мест контактов субъединиц с кор-ферментом, характерных для каждой субъединицы (43–45).

Внутриклеточные уровни различных холоферментных форм рнк-полимеразы e.Coli

Внутриклеточная концентрация в E.coli W3110 (A) является самой высокой для субъединицы σ⁷⁰ среди семи σ-субъединиц E.coli как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах, а также в различных стрессовых условиях (20–22). Исходя из констант диссоциации связывания кор-фермента с внутриклеточными концентрациями, мы можем теперь оценить внутриклеточную концентрацию каждого холофермента (см. Таблицу 1). Концентрация РНК-полимеразы в E.coli W3350 составляет приблизительно 2000 молекул на клетку в экспоненциальной фазе, из которых около трети (700 молекул) остается в цитозоле (3,6). Поскольку общее количество объединенных σ-субъединиц (∼1200 молекул на клетку) больше, чем у РНК-полимеразы, не участвующей в цикле транскрипции (∼700 молекул на клетку), то большая часть РНК-полимеразы в цитозоле должна быть в форме холофермента, связанной с одной из σ-субъединиц. Например, в клетке E.coli W3110, находящейся в экспоненциальной фазе, число каждого холофермента составляет 545 молекул для Eσ⁷⁰, 100 молекул для Eσ^F и 55 молекул для Eσ^N.

Однако считается, что некоторые из субъединиц σ⁷⁰, σ^F и σ^N существуют как комплексы с анти-σ факторами (24,36). Таким образом, фактические концентрации холоферментов Eσ⁷⁰, Eσ^F и Eσ^E в E.coli должны быть ниже уровней, оцененных выше. Например, значительная часть субъединицы σ^F остается в виде комплекса с FlgM (анти-σ^F фактором) в тех же условиях культивирования, что и используемые в этом исследовании (36,37). Активность σ^E регулируется с помощью RseA (регулятор σE или анти-σ^E фактор), который связан с внутренней мембраной и подавляет активность σ^E путем непосредственного взаимодействия с σ^E (38,39). Недавно мы идентифицировали Rsd (регулятор для σ^D), предполагаемую анти-σ⁷⁰-субъединицу, которая вырабатывается в E.coli при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе (25,36). Контроль функциональных форм σ-субъединиц с помощью анти-σ-факторов или σ-переключающих факторов может в определенной степени способствовать регулированию относительных уровней различных форм холофермента (6, 27, 47).