Цитопласты содержат все виды органелл, присущие нормальной клетке, сохраняют способность прикрепляться к субстрату, образовывать складчатую мембрану, передвигаться, осуществлять пиноцитоз.
Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки.
Для реконструкции клеток суспензию кариопластов в солевом буфере добавляют к монослою культуры цитопластов из пропорции 100 кариопластов на 1 цитопласт. Инкубируют при температуре 4оС 45 минут, а затем еще 45 минут при температуре 37оС. Отмывают раствором Эрла для удаления не слившихся кариопластов.
SLIC (Sequence and Ligation-Independent Cloning) метод клонирования
Стив Элледж и Мами Ли разработали оригинальный методом клонирования. Новый метод получил название SLIC (Sequence and LigationIndependent Cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (Ligation-Independent Cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.
Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов.
Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухцепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.
Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек.
Метод генетического перепрограммирования клеток кожи
Этот метод менее трудоемкий, чем тот, что использовался при клонировании овцы Долли. В связи с этим возникли опасения, что однажды он будет использован для обработки эмбрионов человека, дабы формировать детей "по заказу".
Ученые, благодаря этому методу получившие мышат из клеток кожи взрослых особей, обнаружили: такая технология намного более эффективна, чем способ создания Долли, а побочных эффектов у нее меньше - следовательно, она лучше подходит для использования применительно к человеку.
Для клонирования мышей ученые вводили клетки кожи, взятые у взрослой особи, в ткани эмбриона на ранней стадии развития, полученного путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Некоторые из детенышей оказались частичными клонами особей-доноров, а некоторые, как и Долли, стопроцентными.
Однако, в отличие от "метода имени Долли", этот способ настолько прост и эффективен, что возникли опасения: в клиниках, где практикуется ЭКО человека, им могут воспользоваться для помощи бесплодным супружеским парам, которые мечтают о полностью "своем" в биологическом отношении ребенке.
Метод предполагает генетическое перепрограммирование клеток кожи, в результате которого они возвращаются в квазиэмбриональное состояние. В прошлом году, когда эта революционная методика впервые была применена к клеткам кожи человека, Католическая церковь и президент Джордж Буш высоко оценили ее как нравственно-приемлемый способ получения эмбриональных стволовых клеток, не сопряженный с необходимостью создавать или уничтожать человеческие эмбрионы.
Однако тот же метод уже используется в иных целях - для воспроизводства потомства лабораторных мышей, которое является либо стопроцентными клонами, либо генетическими "химерами" взрослых мышей, клетки кожи которых подверглись перепрограммированию.
Эксперименты на мышах показали, что в принципе теперь возможно взять клетку кожи человека, перепрограммировать ее для возврата в эмбриональное состояние, а затем ввести ее в эмбрион человека на ранней стадии. В результате получится ребенок, обладающий некоторыми общими генами не только с родителями эмбриона, но и с человеком, у которого были взяты клетки кожи.
Такой ребенок является химерой - генетической "помесью" двух или большего числа особей - так как некоторые из его клеток происходят от эмбриона, а другие - от клетки кожи. Фактически у такого ребенка будет три биологических родителя. Известны химеры человека, возникающие в естественных условиях - когда в матке соединяются два эмбриона. Часто подобные люди являются совершенно нормальными и здоровыми. По словам доктора Ланцы, нет причин предполагать, что люди-химеры, созданные при помощи нового метода, будут нездоровы.
Более того, эксперименты на мышах показали, что возможно создавать полные клоны - детенышей, которые на 100% идентичны взрослой особи в генетическом плане. Этого удалось достигнуть, используя разновидность дефективных эмбрионов мышей с четырьмя наборами хромосом вместо нормального числа - двух.
Этот "тетраплоидный" эмбрион, развиваясь, превращался исключительно в плаценту плода; когда же в него ввели перепрограммированную клетку кожи, остальная часть плода развилась из этой единственной клетки и сделалась стопроцентным клоном взрослой особи, кожа которой использовалась.
Никто из ученых, разрабатывающих методы перепрограммирования клеток для производства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced Puripotent Stem, сокращенно iPS) - так называют эмбриональные клетки - не планирует применять их в репродуктивной медицине человека. Главная цель ученых - наладить производство стволовых клеток для терапевтического лечения таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и инсульт.
5. Подходы к клонированию человека
Репродуктивное клонирование
Это искусственное воспроизведение в лабораторных условиях генетически точной копии любого живого существа. Овечка Долли, появившаяся на свет в эдинбургском институте Рослин, - пример первого такого клонирования крупного животного.
Процесс делится на несколько стадий. Сначала у женской особи берется яйцеклетка, из нее микроскопической пипеткой вытягивается ядро. Затем в безъядерную яйцеклетку вводится любая клетка, содержащая ДНК клонируемого организма. Фактически, она имитирует роль сперматозоида при оплодотворении яйцеклетки. С момента слияния клетки с яйцеклеткой начинается процесс размножения клеток и рост эмбриона.
Репродуктивное клонирование человека -- предполагает, что индивид, родившийся в результате клонирования, получает имя, гражданские права, образование, воспитание, словом -- ведёт такую же жизнь, как и все
«обычные» люди. Репродуктивное клонирование встречается со множеством этических, религиозных, юридических проблем, которые сегодня ещё не имеют очевидного решения. В некоторых государствах работы по репродуктивному клонированию запрещены на законодательном уровне.
Терапевтическое клонирование
Это то же репродуктивное клонирование, но с ограниченным до 14 дней сроком роста эмбриона. По прошествии двух недель процесс размножения клеток прерывается.
По мнению большинства ученых, после 14-дневного срока в эмбриональных клетках начинает развиваться центральная нервная система и конгломерат клеток (эмбрион, бластоцист) уже следует считать живым существом.
Эмбриональные стволовые клетки обладают уникальной возможностью генерировать практически все типы клеток в организме. Они могут быть использованы для замены пораженных тканей в лабораторных условиях. Кроме того, можно будет больше узнать о молекулярных причинах болезней, изучая линии эмбриональных стволовых клеток клонов больных людей и животных. Также они могут являться отличными моделями для тестирования новых терапевтических препаратов.
Такие клетки будущих органов названы "эмбриональными стволовыми клетками".
Многие исследователи считают, что изучение стволовых клеток в ракурсе терапевтического клонирования является залогом успеха в лечении заболеваний человека. Тем не менее, некоторые эксперты обеспокоены поразительным сходством между стволовыми и раковыми клетками. Оба типа могут размножаться до бесконечности, показано, что в стволовых клетках могут накапливаться мутации, которые могут привести к развитию рака. Таким образом, необходимо более четко понимать связь и разницу между этими типами клеток, а для этого нужны дальнейшие исследования.
В Великобритании ученым разрешается применять терапевтическое клонирование и проводить исследования на стволовых клетках в медицинских целях.
В России многие ученые не любят употреблять выражение "терапевтическое клонирование" и предпочитают называть этот процесс "клеточным размножением".
6. Мнения о клонировании
В случае клонирования животных не нарушаются ни закон, ни моральные нормы. С клонированием человека все обстоит совершенно иначе. В этом случае возникает множество вопросов и споров как юридического, так и этического характера. Как мы уже говорили, процесс клонирования животных, будь то овцы или мыши, неизбежно сопровождается появлением большого количества несовершенных клонов, то есть особей с уродствами и даже мертворожденных. В данном случае эта проблема затрагивает только экономический вопрос, то есть затраты на исследование.
В некоторых государствах использование данных технологий применительно к человеку официально запрещено -- США, Франция, Германия, Япония. Эти запреты, однако, не означают намерения законодателей названных государств воздерживаться от применения клонирования человека в будущем, после детального изучения молекулярных механизмов взаимодействия цитоплазмы ооцита-реципиента и ядра соматической клетки-донора, а также совершенствования самой техники клонирования.
Уголовная ответственность. В настоящее время в мире активно развернулся процесс криминализации клонирования человека. В частности, такие составы включены в новые уголовные кодексы Испании 1995 г., Сальвадора 1997 г., Колумбии 2000 г., Эстонии 2001 г., Мексики (федеральный округ) 2002 г., Молдовы 2002 г., Румынии 2004). В Словении соответствующая поправка в УК внесена в 2002 г., в Словакии - в 2003 г.
Во Франции дополнения в Уголовный кодекс, предусматривающие ответственность за клонирование, были внесены в соответствии с Законом о биоэтике от 6 августа 2004 г.
В некоторых странах (Бразилия, Германия, Великобритания, Япония) уголовная ответственность за клонирование установлена специальными законами. Так, например, Федеральный закон ФРГ о защите эмбрионов 1990 г. называет преступлением создание эмбриона, генетически идентичного другому эмбриону, происходящему от живого или мертвого лица.
В Великобритании соответствующие уголовные нормы содержит Закон о репродуктивном клонировании человека 2001 г. (Human Reproductive Cloning Act 2001), который предусматривает санкцию в виде 10 лет лишения свободы.
При этом терапевтическое клонирование человека разрешено.
В США запрет на клонирование впервые был введен еще в 1980 г. В 2003 г. Палата представителей Конгресса США приняла закон (Human Cloning Prohibition Act of 2003), по которому клонирование, нацеленное как на размножение, так и на медицинские исследования и лечение, рассматривается как преступление с возможным 10-летним тюремным заключением и штрафом в 1 млн. долларов.
Наконец, в Японии парламентом 29 ноября 2000 г. был принят «Закон, регулирующий применение технологии клонирования человека и других сходных технологий», содержащий уголовные санкции.
В России Государственной думой 19 апреля 2002 г. был принят
Федеральный закон «О временном запрете на клонирование человека» от 20.05.2002 г. № 54-ФЗ. 8 мая 2002 г. Советом Федерации данный закон был направлен Президенту РФ без рассмотрения….
Федеральный закон «О временном запрете на клонирование человека» принят для обеспечения правовой защиты прав человека, а также его достоинства. В целом закон призван ограничить деятельность по клонированию человека на территории Российской Федерации. Вместе с тем данный закон не ставит неоправданных препятствий перед проведением научных исследований и разработкой новых технологий в области генетики.