Исследования поддержаны грантами РФФИ №12-04-31268 мол_а «Роль киназы гликогенсинтазы 3 бета в патогенезе депрессивных и биполярных аффективных расстройств» (2012-2013), РФФИ № 14-04-01157 А «Поиск биомаркеров депрессивных и аффективных расстройств» (2014-2016) и ФЦП «Научно и научно-педагогические кадры современной России» (Соглашение № 8140) «Разработка комплекса маркеров основных социально значимых психических расстройств на основе изучения молекулярно-генетических механизмов дизрегуляции нейрональных протеинкиназных сигнальных путей» (2012-2013). иПубликации. По теме диссертации опубликована 25 работ, из которых 6 в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, глава в монографии, учебно-методическое пособие, патент РФ, новая медицинская технология.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель включает 228 источников: 49 отечественных и 179 зарубежных авторов.
1. Материал и методы исследования
Формирование групп, клиническая верификация диагноза выполнена на базе отделения аффективных состояний НИИ психического здоровья (руководитель отделения - д-р мед. наук, профессор Е. Д. Счастный). Группу контроля составили психически и соматически здоровые лица, сопоставимые по полу, не имеющие хронических заболеваний и не состоящие на диспансерном учете, без признаков, перенесенных острых инфекционных заболеваний на момент обследования. Критериями включения в группу обследуемых лиц было наличие установленного диагноза в рамках F31-F33, МКБ-10 (депрессивный эпизод, рекуррентное депрессивное расстройство, биполярное аффективное расстройство), возраст пациентов от 20 до 60 лет, наличие подписанной формы информированного согласия на участие в исследовании, этническая принадлежность к славянской популяции. В критерии исключения входили возраст старше 60 лет, наличие расстройств шизофренического спектра (F2), эпилепсии, декомпенсированных форм расстройств личности. Для группы пациентов с БАР критерием исключения явился прием препаратов лития на момент поступления в стационар, т.к. известно, что литий способен блокировать фосфорилирование GSK-3в по серину-9 (Freland L. et al., 2012). Помимо этого критерием исключения для всех пациентов явилось наличие сахарного диабета, т.к. предполагается, что дизрегуляция GSK-3в вовлечена в патогенез данной патологии (Jope R. et al., 2007).
Для группы контроля критериями включения стали письменное информированное согласие, возраст от 20 до 60 лет, этническая принадлежность к славянской популяции, критериями исключения - наличие психических расстройств, соматической патологии в стадии обострения. Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами ведения исследований человека согласно протоколу, утвержденному комитетом по Биомедицинской этике НИИ психического здоровья. Комплексное исследование молекулярно-биологических признаков выполнено на базе лаборатории молекулярной генетики и биохимии (руководитель лаборатории - д-р мед. наук, профессор С. А. Иванова) НИИ психического здоровья (директор - член-корреспондент РАН, профессор, д-р мед. наук, заслуженный деятель науки РФ Н. А. Бохан). Генетические исследования были проведены согласно этическим принципам медицинской генетики. У всех обследованных лиц получено информированное согласие.
Всего в рамках исследования обследовано 225 человек. Среди них 122 пациента с текущим депрессивным эпизодом в рамках депрессивных расстройств (106 человек) и биполярного аффективного расстройства (16 человек), 103 здоровых донора (табл. 1). Дополнительно в группе пациентов с депрессивными расстройствами были выделены следующие подгруппы: пациенты с единственным депрессивными эпизодом (60 человек) и пациенты с текущим депрессивным эпизодом в рамках рекуррентного депрессивного расстройства (46 человек) (табл. 2).
Таблица 1. Характеристика исследованных групп контроля и больных по полу и возрасту
Методы психометрического обследования. Для объективизации тяжести текущей депрессии в нашем исследовании использовалась 24 пунктовый вариант шкалы SIGH-SAD, включающий 17 пунктов шкалы депрессии Гамильтона и 7 пунктов, оценивающих атипичные депрессивные симптомы (социальный отход, увеличение аппетита, увеличение веса, увеличение количества потребляемой пищи, предпочтение углеводистой пище, гиперсомния, утомляемость) (Williams J.B.W et al., 1988). Рассчитывались отдельно суммарный балл, балл для типичных депрессивных симптомов, балл для атипичных депрессивных симптомов. Тяжесть состояния и эффективность терапии также оценивалась по шкале общего клинического впечатления (CGI), включающей в себя подшкалы, оценивающие тяжесть состояния и динамику улучшения - CGI-S и CGI-I (Guy W., 1976). Психометрическое исследование проводилось при поступлении, а также на 14 и 28 дни терапии.
Таблица 2. Характеристика исследованных групп больных депрессивными расстройствами по полу и возрасту
Определение внутриклеточных белков методом иммуноблоттинга. Материалом для исследования служила венозная кровь обследуемых лиц, взятая с 8.00 до 9.00 натощак из локтевой вены до начала терапии, в пробирки фирмы BDVacutainer, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Из цельной крови выделялись мононуклеары путем центрифугирования на градиенте плотности фиколла (с=1,077 г/см3) («Sigma-Aldrich», США) по стандартной методике (Натвиг Д.Б., 1980). Далее мононуклеары аликтвотировали в количестве 2106 и использовали для приготовления клеточных лизатов для последующего определения специфических белков. К выделенным из периферической крови мононуклеарам в количестве 2106 добавляли 4 мкл смеси протеиназных ингибиторов («Fermentas», США), 2 мкл смеси ингибиторов серин-треониновых фосфатаз («Sigma-Aldrich», США) и 200 мкл лизирующего буфера (50 ммоль Трис-HCl (рН=6,5), 100 ммоль дитиотреитола, 0,1% бромфеноловый синий, 10% глицерол, 2% натрия додецилсульфат). Затем тщательно перемешивали и инкубировали 15 минут при 95єС. Остывшие до комнатной температуры лизаты еще раз перемешивали и центрифугировали 10 минут при 12000 об/мин и отбирали надосадок. Полученные клеточные лизаты в объеме 20 мкл использовались для электрофореза в SDS-полиакриламидном геле по стандартной методике (Laemmli U.K., 1970). Для последующего исследования белки переносили на ПВДФ (поливинилденфторид)-мембрану (Bio-Rad, США) на приборе Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, США). Далее мембраны инкубировались с первичными (в разведении 1:1000) и вторичными антителами (в разведении 1:300) (Abcam, Великобритания) с последующей хроматографической детекцией по набору Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad, США). Вычисление оптической плотности полосы исследуемого белка и обработку изображения проводили с использованием системы гель-документации Alliance 2.7 (Uvitech Cambridge, Великобритания). Уровень исследуемого белка в пробе рассчитывался как отношение к рефересному сигналу в-актина (общая GSK-3в/в-актин, общая Akt1/в-актин). Относительный уровень фосфоформ GSK-3в и Akt1 рассчитывался по отношению к уровню их общих фракций (фосфо-серин-9 GSK-3в/общая GSK-3в, фосфо-серин-473 Akt1/общая Akt1).
Определение аллельных вариантов генов AKT1 и GSK3B методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Материалом для исследования служила венозная кровь обследуемых лиц, взятая с 8.00 до 9.00 натощак из локтевой вены до начала терапии, в пробирки фирмы BDVacutainer, содержащие ЭДТА. Выделение геномной ДНК из цельной крови осуществляли с использованием набора «Силика» («Медиген», Россия) использованием лизиса клеток гуанидинизотиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на стеклянном носителе. К 100 мкл крови добавляли 300 мкл раствора 1 и 10 мкл сорбента, перемешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре, перемешивая каждые 3 минуты. Пробы центрифугировали 60 сек при 5000 об/мин, супернатант отбирали и отбрасывали. К осадку добавляли 150 мкл раствора 2, перемешивали и осаждали сорбент центрифугированием 60 сек при 5000 об/мин, супернатант отбирали и отбрасывали. К осадку добавляли 0,7 мл раствора 3, перемешивали и осаждали сорбент центрифугированием 60 сек при 5000 об/мин. Супернатант отбрасывали, осадок подсушивали при 50єС в течение 5 мин. В пробирки добавляли 50 мкл дистиллированной воды, перемешивали, инкубировали в течение 5 мин при 50єС. Затем пробы центрифугировали 60 сек при 12000 об/мин. Супернатант, содержащий геномную ДНК, отбирали в чистые пробирки. Генотипирование по SNP (single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм) гена AKT1 (rs1130214 и rs3730358) а также гена GSK3B (rs334558 и rs645582) проводили методом real-time PCR с использованием наборов TaqMan® SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems, США). Амплификацию и анализ результатов осуществляли с помощью прибора StepOnePlus (Applied Biosystems, США).
Иммуноферментный анализ для определения концентраций серотонина и дофамина. У всех обследуемых лиц брали кровь из локтевой вены в период с 8.00 до 9.00 натощак в пробирки фирмы BDVacutainer с активатором свертывания для получения сыворотки, а также в пробирки с ЭДТА для получения плазмы. Концентрацию серотонина определяли в сыворотке крови. Концентрация дофамина была определена в плазме крови. Для получения сыворотки и плазмы кровь центрифугировали при 4750 об/мин при 4єС. Определение концентрации серотонина и дофамина проводили методом иммуноферментного по наборам реактивов Serotonin ELISA Fast Track и Dopamine ELISA Fast Track (Labor Diagnostika Nord, Германия). Постановку реакции проводили согласно прилагаемым к наборам инструкциям с обязательным контролем стандартных позитивных и негативных сывороток, входящих в состав тест-системы. Результаты ИФА оценивали на автоматическом микропланшетном спектрофотометре Epoch (BioTek Instruments, США) при длине волны 450 нм. Конечные результаты выражали в единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями для построения калибровочных графиков из стандартных навесок определяемых веществ (нг/мл для серотонина, пг/мл для дофамина).
Статистическая обработка данных. Был использован пакет прикладных программ SPSS 20.0. Для проверки соответствия распределения частот генотипов генов GSK3B и AKT1 равновесию Харди-Вайнберга использовался критерий чІ Фишера. Сравнение частот генотипов и аллелей двух анализируемых групп проводили с помощью критерия чІ Фишера. Различия считали достоверными при р<0,01. Для каждой выборки вычисляли медиану, 25% и 75% квартили, статистическую значимость различий между группами определяли по критериям Манна-Уитни (для двух независимых выборок), Краскела-Уоллеса (для более двух независимых выборок), Вилкосона (для двух зависимых выборок). Корреляционный анализ проводился с расчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (r). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
2.Основные клинические характеристики пациентов с аффективными расстройствами
В основную клиническую группу вошло 122 пациента (95 женщины, 27 мужчин) с текущим депрессивным эпизодом различной степени тяжести в рамках F31-F33 (МКБ-10), средний возраст которых составил 45,50 (35,7 - 54,2) лет. Диагностическая структура аффективных расстройств в основной группе была представлена единственным депресcивным эпизодом (60 человек - 48%), текущим депрессивным эпизодом в рамках рекуррентного депрессивного расстройства (46 человек - 39%) и биполярного аффективного расстройства (16 человек - 13%). Тяжесть текущего депрессивного эпизода в основной группе, оцененная по шкале депрессии Гамильтона (HDRS-17), составила 23,50 (16,25 - 30,50) балла, что соответствует умеренно выраженной депрессии. Распределение пациентов по степени тяжести текущего депрессивного эпизода, оцененной по субшкале тяжести шкалы общего клинического впечатления (The clinical global impression-severity, CGI-S) было следующим: легкий депрессивный эпизод встречался в 3 случаях (2,4%), умеренный депрессивный эпизод в 107 случаях (87,8%) и тяжелый депрессивный эпизод в 12 случаях (9,8%). Таким образом, в основной группе преобладали пациенты с текущим депрессивным эпизодом умеренной степени тяжести. Оценка синдромальной структуры у пациентов основной группы показала высокую встречаемость (p<0,05) простой депрессии (45,6%) а также тревожно-депрессивного синдрома (39,0%) (табл. 3).
Таблица 3. Синдромальная структура текущей депрессии в исследуемых группах
Доля пациентов с атипичной депрессивной симптоматикой (в соответствии с критериями DSM-5) составила 25,2% (n=31). При этом при наличии атипичной депрессии наиболее часто из так называемых инвертированных симптомов депрессии встречались гиперсомния (37,2%), повышенный аппетит (43,6%) и повышение веса тела (43,6%).
3.Внутриклеточное содержание белков Akt1/GSK-3в-сигнального пути у больных депрессивными и биполярными расстройствами
Для выявления дизрегуляции киназы гликогенсинтазы 3в в группах контроля и больных было изучено содержание общей GSK-3в, ее неактивной фосфорилированной по серину-9 формы в мононуклеарах периферической крови. Для более полного представления о функционировании данного белка проведено измерение негативного регулятора GSK-3в - протеинкиназы Akt1, как общей, так и активной, фосфорилированной по серину-473 форм. Уровни общей GSK-3в, фосфо-серин-9 GSK-3в, общей Akt1 и фосфо-серин-473 Akt1 в группах больных и контроля представлено в таблицах 4 и 5. Обращает на себя внимание факт повышения общей GSK-3в в группах больных депрессивными расстройствами и БАР, а также статистически значимое повышение данного показателя у пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством по сравнению с пациентами, имеющими единственный депрессивный эпизод. Статистически значимых различий в содержании фосфо-серин-9 GSK-3в между группами выявлено не было. Исследование выявило снижение общей Akt1 в группах больных депрессивными расстройствами и по сравнению с контрольной группой. Обнаружено низкое содержание фосфо-серин-473 Akt1 у больных депрессивными расстройствами (табл. 4). Различий по данным показателям между группами пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством либо единственным депрессивным эпизодом не выявлено (табл. 5).
Таблица 4. Содержание общей GSK-3в, фосфо-серин-9 GSK-3в, общей Akt1 и фосфо-серин-473 Akt1 в группах контроля и больных аффективными расстройствами (Me (25%Q-75%Q))
Таблица 5. Содержание общей GSK-3в и фосфо-серин-9 GSK-3в в группах больных с единственным депрессивным эпизодом и рекуррентным депрессивным расстройством (Me (25%Q-75%Q))
В настоящее время считается, что высокая активность GSK-3в может быть одним из механизмов формирования симптомов аффективных расстройств, как депрессивных, так и маниакальных (Li X. et al., 2010). Наши данные о высоком уровне данного белка у больных с БАР согласуются с ранее выполненными работами (Li X. et al., 2007; Pandey G.N. et al., 2010). Вероятно, что повышение GSK-3в может играть роль в прогрессировании аффективной патологии и обусловливать рецидивирующее течение рекуррентной депрессии и БАР. Известно, что фосфорилирование по серину-9 ингибирует функцию GSK-3в. Наше исследование не выявило различий в содержании фосфо-серин-9 GSK-3в, что не вполне согласуется с ранее полученными данными (Li X. et al., 2007; Polter A.M. et al., 2010). Причина в отсутствии различий в содержании фосфоформы GSK-3в остается пока не ясной. Вероятно, это результат недостатка дофамина, ингибирующего фосфорилирование GSK-3в. Активность GSK-3в также зависит от фосфорилирования по серину-398 и тирозину-216 и, вероятно, этот процесс может быть более важен для патогенеза депрессии (Lesort M. et al., 1999; Thornton T.M. et al., 2008).