Материал: Исследование биологической активности почвы, загрязненной солями цинка

Содержание цинка в почве снижается достаточно быстро. Период его полуудаления из почвы, где он содержится в соотношении 2210 мг металла на 1 кг почвы, его концентрация понизится наполовину 10-11 лет. Однако подобные результаты применимы только к образцам с длительной промывкой (Силков, 2010).

Загрязнение почвы цинком имеет иное воздействие, нежели различные физические воздействия на почвы, а также часто значительно превосходит его в качественном и количественном отношении. Изменения почвенных параметров происходят спустя короткий или длительный промежуток времени в зависимости от условий, концентрации и формы, в которой содержится металл (Силков, 2010).

В зависимости от химического состояния поллютантов их можно разделить на соли, пыль, газы, агрохимикаты, радиоактивные осадки, органические жидкости, органические газы. В атмосферном воздухе цинк может содержаться в составе пыли и аэрозолей, накапливаясь в верхнем слое почве путем осаждения. Следует также отметить, что цинк обладает высокой способностью накапливаться в организме, увеличивая свою концентрацию по мере восхождения по пищевой цепочке, т.е. биоаккумулироваться (Майстренко и др., 1996).

Комплексное воздействие поллютанта на почвогрунты способно создать источник опасности для живых организмов. Одним из проявлений цинкового загрязнения является значительное повышение в почве количества микотоксинов, выделяемых некоторыми микроскопическими грибами, оказывающих крайне негативное воздействие на микробоценоз почвы. При этом возможно частичное подавление или даже полное ингибирование роста и жизнедеятельности ключевых групп почвенных микроорганизмов (Дедков, Куркина, 2009).

Сочетание всех перечисленных негативных факторов, способно значительно подорвать способность почвы к самоочищению, дать толчок к упадку плодородия. Данные свойства почвы обеспечиваются микроорганизмами, обладающими большим разнообразием ферментных систем и высокой функциональной мобильностью метаболизма. Чем активнее почвенные микроорганизмы, тем быстрее протекает круговорот веществ в экосистеме. Это повышает экологическую устойчивость живой системы. При этом нарушение микробоценоза почвы может служить причиной негативных изменений или даже разрушения экосистемы. Поэтому необходимо своевременно обнаруживать критические изменения в биологической активности почвы, являющиеся в некоторых случаях показателем высокого загрязнения соединениями цинка или другими поллютантами.

Микроорганизмы чутко реагируют на изменения условий. Ответные реакции протекают быстро и проявляются в изменении роста, активности метаболических процессов, морфологического строения, накопления или выделения различных веществ и элементов. При этом изменения отражаются на популяционном и экосистемном уровнях. Это может быть качественное и/или количественное изменение состава сообщества, вплоть до изменения состояния доминантных групп микроорганизмов. Реакции микроорганизмов на популяционном уровне выражаются в изменении интенсивности их роста и развития в зависимости от конкретных условий (Дедков, Куркина, 2009).

Глава 2. Материалы и методы исследования

.1 Объект исследования

Объектом исследования являлись почвогрунты, расположенные на ключевом участке в зеленой зоне поселка Прибрежный, в городской черте Калининграда - сад на пришкольной территории. Приблизительная локализация ключевого участка обозначена на рисунке (рис. 1).

Рис. 1 Схема расположения ключевого участка.

Согласно литературным источникам, вся территория города и прилегающих к нему земель разделена с учетом комплекса факторов воздействия на шесть зон: относительно чистая, слабо загрязненная, умеренно загрязненная, загрязненная, грязная и очень грязная. К факторам воздействия условно относят: акустический режим, уровни и интенсивность загрязнения почвы, воды, атмосферного воздуха, состояние растительности и т.д. Ключевой участок в поселке Прибрежный относят к слабо загрязненной зоне (Ващейкин, Садовников и др. 2014).

Координаты участка определяли с помощью технологий GPS-навигации (N 54° 64.879' E 020° 33.206'). Размер тестовой площадки - 20 м2. Ключевой участок представляет собой пришкольный сад - небольшую зеленую зону на антропогенно трансформированном участке почвы с полукультурными насаждениями (посадки яблони, вишни и сливы) и разнотравьем (крапива, тысячелистник, полынь, одуванчик). Сомкнутость крон в древесном ярусе небольшая и составляет около 20 %. Общее проективное покрытие в травяно-кустарничковом ярусе составляет 80%. Листовой опад практически отсутствует. Почва супесчаная (Анциферова, Мурачева, 2009), дерново-слабоподзолистая, окультуренная (Куркина, Дедков, 2012). Площадка ровная.

Отбор почвенных образцов осуществляли традиционным для взятия почвенных проб методом конверта: по периметру и в центре ключевого участка (рис. 2), с соблюдением стерильности.

Рис. 2 Точки взятия почвенных образцов на ключевом участке методом конверта в пос. Прибрежный (черными точками указаны места отбора проб).

Непосредственный сбор образцов осуществляли стерильной лопаткой, предварительно стерилизуемой в пламени спиртовки. Сбор почвенных образцов проводили из разреза почвы глубиной 10см.

Собранная почва перемешивалась и складировалась в предварительно простерилизованные бумажные пакеты. Одновременно осуществляли сбор почвенных образцов в металлические бюксы (50-60г) с теневой стороны почвенного разреза, для дальнейшего определения её влажности и полной влагоёмкости в лабораторных условиях. Бумажные пакеты с собранной почвой снабжались этикетками с соответствующей пометкой - датой и местом сбора.

Попутно с помощью портативного pH-метра, оснащенного температурным датчиком, измерялось значение pH и температура почвы на уровне взятия проб с каждой точки конверта. Средняя температура почвы составила 7,3 градуса по шкале Цельсия, среднее значение pH - 6,29.

Естественная влажность почвы определялась термостатно-весовым методом (Козлова, 2009). Отобранные образцы с бюксами взвешивались, затем помещались в сушильный шкаф для высушивания при температуре 105-110 °С в течение 6 часов. Затем проводилось контрольное взвешивание. Определение полной влагоемкости почвы осуществлялся методом цилиндра (Чупахина, 2000).

.2 Ход эксперимента

Исследования проводили в ходе эксперимента на базе лаборатории микробиологии и биотехнологии Химико-биологического института БФУ им. И. Канта в апреле 2015 года.

Перед проведением эксперимента предварительно определили уровень загрязнения цинком собранных почвенных образов с помощью волнодисперсионного рентгенофлуоресцентного спектрометра «Спектроскан Макс-G» (Спектрон, 2012). Предварительно высушенные образцы почвы измельчали с помощью дискового истирателя ЛДИ-65 до размера частиц 71 мкм. Полученные таким образом пробы спрессовывали в виде таблеток диаметром 1 см и помещали в прибор «Спектроскан Макс-G» для определения валового содержания цинка. Содержание цинка в пробах составило 35 мг\кг почвы, тогда как значение ПДК для почвенного цинка не должно превышать 55 мг\кг абсолютно сухой почвы. Таким образом, загрязнение цинком почвы на ключевом участке «Ж1» не превышает предельно допустимой концентрации.

Доставленные в лабораторию почвенные образцы освобождались от камней, корней и прочих включений, тщательно просеивались и помещали в семь пластиковых сосудов: по 50г очищенной и просеянной почвы в каждый сосуд. Затем добавляли в каждый сосуд кроме контрольного образца различную добавочную дозу цинка в виде сульфата (ZnSO4) (таблица 1).  Затем почва выдерживалась в течение 2 недель при комнатной температуре. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% от полной влагоемкости почвы - однократно в день, в течение трех недель образцы почвы в сосудах увлажнялись из расчета 60% от полной влагоемкости почвы). Таким образом почва в сосудах «загрязнялась» цинком сверх контрольного значения. Для эксперимента были взяты шесть значений (таблица 1). Поскольку результаты предыдущих экспериментов, базирующихся на всего трех концентрациях с более узким диапазоном - 100 ПДК, 500 ПДК, 1000 ПДК в первом эксперименте (2013) и 100 ПДК, 500 ПДК, 750 ПДК во втором (2014) - не позволили выявить четкую зависимость численности определенных групп микроорганизмов от концентрации поллютанта, было принято решение расширить эксперимент. Большее количество экспериментальных концентраций позволило увеличить границы исследуемого «интервала», в пределах которого ингибировалась или стимулировалась активность тех или иных групп почвенных микроорганизмов с увеличением содержания металла-загрязнителя. Подобное решение так же поспособствовало не только нахождению точек ингибирования, но и более успешному выводу какой-либо общей зависимости при отображении результатов исследования в виде графиков. 

Экспериментальные значения ПДК вычислялись пропорциональным методом: ПДК металла, умноженная на молекулярную массу соединения (сульфат цинка) и разделенное на молекулярную массу тяжелого металла (Мосина, 2013). Полученные значения умножались соответственно на 100, 500 750, 1000, 1250 и 1500. Используемый спектр концентраций обусловлен слабыми реакциями групп почвенных микроорганизмов на более низкие концентрации цинка, используемые в предыдущих исследованиях, а узкий диапазон ПДК не позволит эффективно выявить точки ингибирования и стимуляции активности. Важно, что значения ПДК для экспериментальных подсчетов переводились в соотношения 1 мг на 100 г почвы.

Таблица 1

Добавочная доза цинка в сосудах с исследуемой почвой

Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний использовался метод разведений (рис. 3) (Егоров, 1995). В ходе опыта был использован коэффициент разведения равный 10. Для приготовления более качественных разведений исследуемые почвенные суспензии предварительно перемешивались с помощью лабораторного орбитального шейкера в течение 20 минут. Для приготовления разведений заранее подготовленную стерильную водопроводную воду разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносили в пробирку с 9 мл стерильной воды, таким образом подготавливалось первое разведение.

Рис. 3 Схематическое изображение метода разведений

Полученное разведение тщательно перемешивали новой стерильной пипеткой, осуществляя забор в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию. Затем той же пипеткой отбирали 1 мл суспензии и переносили во вторую пробирку, получая второе разведение. Остальные разведение были получены идентичным образом. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно чем больше степень разведения суспензии, тем больше плотность потенциальной популяции.

По истечении времени выдержки почвенных образцов, загрязненных добавочной дозой цинка, осуществлялась процедура глубинного микробиологического посева. Для культивирования каждой ключевой группы микроорганизмов использовались твердые селективные питательные среды: крахмало-аммиачный агар (КАА) для микроорганизмов использующих минеральные формы азота, среду Чапека для микроскопических грибов, среду Гетчинсона для целлюлозоразлагающих микроорганизмов, сусло-агар с мясопептонным агаром (СА+МПА) для спорообразующих бактерий, среду Эшби для азотфиксирующих микоорганизмов, мясо-пептонный агар (МПА) для аммонифицирующих микроорганизмов. При приготовлении питательных сред использовалась стандартная рецептура (Тихонович, 2005).

Эксперимент проводился в трех повторностях для каждой добавочной концентрации и контрольного значения на всех средах с последующей выдержкой в биологических термостатах на срок до 14 дней. После термостатной выдержки производился подсчет колоний визуальным методом с внесением данных в заготовленные таблицы и последующим пересчетом в колониеобразующие единицы. Параллельно с этим производилось идентификация родового состава доминирующих групп (использовался практикум Теппера) микроорганизмов, если это представлялось возможным. Определение доминантных групп осуществлялось путем оптической микроскопии и приготовлением постоянных препаратов. При определении учитывались характер колоний и морфология отдельных клеток.

Полученные данные были обработаны статистически с помощью программы Microsoft Excel 2013. Для построения диаграмм, отражающих изменение количественных показателей и динамики численности групп различных микроорганизмов, использованы средние значения, полученные в результате обработки и обобщения полученных данных.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Проведенный эксперимент позволил исследовать влияние загрязнения цинком на различные группы почвенной микрофлоры. По результатам эксперимента можно судить, что дополнительные дозы цинка (в виде сульфата), внесенные в исследуемые почвенные образцы в количестве 100, 500, 750, 1000, 1250 и 1500 ПДК с ключевого участка приводят к различным изменениям у исследуемых групп микроорганизмов, как в качественном, так и в количественном составе.

По результатам эксперимента было установлено, что целлюлозоразлагающие микроорганизмы являются наиболее чувствительными к загрязнению почвы цинком. На грамм абсолютно сухой почвы их содержание в колониеобразующих единицах (КОЕ) сводится к практически абсолютному отсутствию уже при первой добавочной дозе цинка (рис. 4).

Рис. 4 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде Гетчинсона (здесь и далее вертикальным интервалом отображено стандартное отклонение от средней величины).

Повышенное содержание цинка в почве приводит к полному ингибированию активности этой группы почвенных микроорганизмов. С возрастанием добавочной дозы этого поллютанта динамика численности целлюлозоразлагающих микроорганизмов не изменяется. Становится ясно, что данная группа является неустойчивой к цинковому загрязнению - количество этих микроорганизмов резко снижается с 48 КОЕ/г в контрольном значении до полного отсутствия в экспериментальных концентрациях.

На контрольных образцах почвы содержание данных микроорганизмов относительно невелико, что может объясняться высокой их чувствительностью к содержанию цинка в почве в целом. На территории ключевого участка содержание цинка не превышает предельно допустимой концентрации, но приближается к ней.

Общая тенденция сводится к постепенному снижению количества микроорганизмов на грамм почвы к концентрации 500 ПДК - с 77 КОЕ/г в контрольной пробе до 10 КОЕ/г, затем численность микроорганизмов начинает медленно восстанавливаться, достигая 42 КОЕ/г на концентрации в 1250 ПДК и 32 КОЕ/Г на 1500 ПДК. 

Группы организмов, использующих минеральные формы азота, демонстрируют большую (в сравнении с целлюлозодеструкторами) устойчивость к воздействию добавочных доз цинка (рис. 5). Значительные концентрации не оказывают сильное угнетающее действие на эту группу микроорганизмов, и их активность не ингибируется.  При концентрации 100 ПДК, 500 ПДК и максимальной - 1500 ПДК - наблюдается значительное увеличение численности микроорганизмов (до 14,7·106 КОЕ/г), превышая значения таковой в контрольных пробах (8,9·105 КОЕ/г). Наименьшее количество обнаружено при уровне загрязнения цинком 1000 ПДК и 1250 ПДК - 5,1·105 КОЕ/г и 4,9·105 КОЕ/г соответственно.  При повышении концентрации поллютанта прослеживалось незначительные колебания численности микроскопических грибов. Однако, их доля в общем количестве исследуемой группы микроорганизмов не слишком велика, она достигает максимальных значений только при угнетении других микроорганизмов, использующих минеральные формы азота в пробах с концентрациями цинка 1000 и 1250 ПДК.