В литературе накопилось достаточно данных о выраженном влиянии фибронектина, входящего в состав клеточно-инженерных конструкций, на поведение и свойства клеток. Было показано, что иммобилизация фибронектина на синтетических скаффолдах способствует повышению пролиферативной активности гемопоэтических стволовых клеток
CD34+ [32]. Ранее Bourdoulous et al. [33] показали, что разрушение естественной фибронектиновой матрицы на апикальной поверхности клеток без изменения клеточного субстрата адгезии ингибировало миграцию и пролиферативную активность эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) и фибробластов человека, при этом адгезионные свойства культур оставались без изменений.
В то же время следует отметить, что значимого воздействия на жизнеспособность клеток разрушение фибриновой матрицы не оказывало. Подавление миграции клеток наблюдается и при модификации фибронектиновой матрицы.
Так, изменение структуры матрицы фибронектина путем формирования дисульфидных сшивок между молекулами с организацией мультимеров относительно высокой молекулярной массы в значительной степени подавляло миграцию клеток [34].
Модификации в фибриллярной структуре фибронектиновой матрицы оказывают значительное влияние на клеточную пролиферацию, что обусловлено изменением регуляторных сигналов, поступающих к клеткам. Обнаружено, что мутантный фибронектин (FNDeltaIII1-7), который содержит все известные клеточные связывающие последовательности, но образует структурно отличающуюся от нормального фибронектина матрицу, тормозит прогрессию клеточного цикла от фазы G0/G1 в фазу S.
В то время как матрица из нормального фибронектина стимулирует рост этих же клеток [35]. Один из механизмов действия фибронектина на пролиферативную активность и миграцию клеток реализуется через сигнальные белки Ras. Нарушения фибронектиновой матрицы вызывают реорганизацию цитоскелета путем активации малой Rho-ГТ- Фазы Cdc42, изменяя передачу сигналов фактора роста и прогрессии блоков клеточного цикла. В то же время, активация Rho способствует сборке самой фибронектиновой матрицы на поверхности клеток [33, 36, 37].
В литературе появились данные, свидетельствующие о том, что рассмотрение роли фибронектина в клеточно-инженерных конструкциях не может быть ограничено только его непосредственным влиянием на рост и пролиферативную активность клеток.
Так, в работе A. Ramanathan и N. Karuri [38] показано, что концентрация фибронектина положительно коррелирует с начальной скоростью образования фибриновой матрицы и может моделировать ее трехмерную структуру путем регулировки толщины и плотности волокон фибрина, ковалентно и нековалентно связываясь с фибриновой матрицей с образованием высокомолекулярных мультимеров.
Известно, что благополучная имплантация клеточно-инженерных конструкций во многом связана с последующим успешным развитием ангиогенеза, обеспечивающим доставку питательных веществ и кислорода к клеткам и обуславливая таким образом восстановление тканей.
Относительно недавно стали появляться исследования, свидетельствующие о ключевой роли фибронектина в процессе образования сосудов. Так, например, было показано, что дефицит фибронектина у мышей вызывает их гибель во время эмбриогенеза вследствие формирования тяжелых сосудистых дефектов [39].
В последующих работах были изучены основные механизмы, посредством которых фибронектин влияет на ангиогенез. Известно, что фибронектин способен связываться и активировать интегрины а5в1 и ауР3, которые играют центральную роль в регуляции внутриклеточных сигналов, обуславливающих в том числе выживаемость клеток, их миграцию и клеточный цикл [40, 41].
При этом домены в молекуле фибронектина, отвечающие за его взаимодействие с этими интегринами недоступны, если молекула фибронектина находится в глобулярном состоянии, и становятся доступны при его полимеризации и организации фибриллярной структуры [42].
Блокирование интегринов а5в1 и ауР3 эндотелиальных клеток антителами предотвращает их взаимодействие с фибронектином, что приводит к подавлению сосудистого морфогенеза. Этот же эффект наблюдается при отсутствии матрицы из полимеризованного фибронектина на поверхности клеток [43].
Фибронектин оказывает непосредственное влияние на активацию эндотелиальных клеток, что приводит к их переходу из состояния покоя в активное состояние, при котором клетки проявляют повышенную миграцию и пролиферацию.
Методами математического моделирования показано, что фибронектин влияет на ангиогенез не только путем прямой сигнализации при взаимодействии с интегринами, но и опосредованно через механорегуляцию. Интересно, что при этом фибронектин способен выступать в качестве негативного регулятора ангиогенеза.
Механическое растяжение клетками полимеризованного фибронектина может создавать избыточное напряжение фибрилл в структуре фибронектиновой матрицы. Это формирует условия ингибирующие процесс васкуляризации и пролиферацию клеток [44].
Выступая в качестве механотрансдуктора, фибро- нектин внеклеточного матрикса способен регулировать дифференцировку мезенхимальных стволовых
клеток (MSC) в остеогенном направлении [45]. Остеогенез усиливается, когда avP3 интегрины блокируются при расслаблении фибронектиновых волокон. Растяжение этих волокон приводит к блокированию a5Pt интегринов или ингибированию сигнализации рецептора эпидермального ростового фактора (EGF) и в результате снижается активность остеогенеза.
Авторами высказывается мнение о том, что механорегуляция волокон фибронектина может служить контрольной точкой для регуляции дифференциров- ки MSC в остеогенном направлении. В связи с этим в области тканевой инженерии появился ряд работ, рассматривающих фибронектин в качестве активного компонента костнозамещающих скаффолдов из синтетических материалов и биокерамики.
О возможной роли фибронектина плазмы крови в клеточно-инженерных конструкциях в качестве дополнительного индуктора дифференцировки, который может модулировать их свойства через активность металлопротеиназ (MMPs), сообщалось в обзорном сообщении, посвященном рассмотрению вопросов дифференцировки стволовых клеток в скаффолдах из плазмы крови [46].
По результатам этих работ можно сделать вывод о специализированной роли фибронектина во внеклеточном матриксе. При этом фибронектин способен выступать в качестве регулятора ангиогенеза, механотрансдуктора и непосредственного активатора интегринов клеток и являться элементом управления клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки.
Обогащенная тромбоцитами плазма/ лизат тромбоцитов/ тромбоцитарные факторы
Развитие скаффолд-технологий требует разработки не только внеклеточного матрикса как механической поддерживающей структуры, но и обеспечения условий для поддержания определенной активности клеточных процессов и питания клеток на период до наступления полной васкуляризации скаффол- да после трансплантации.
В связи с этим большое распространение в тканевой инженерии получили тромбоцитарные продукты, такие как обогащенная тромбоцитами плазма (PRP), лизат тромбоцитов (PL) и отдельные факторы, выделенные из тромбоцитов. Это связано с тем, что тромбоциты содержат большое количество разнообразных биологически активных веществ, регулирующих целый ряд клеточных процессов, обуславливающих регенерацию тканей и развитие ангиогенеза [47, 48].
Применение отдельных биологически активных факторов тромбоцитов или «коктейлей» из них является одним из вариантов функционализации клеточно-инженерных конструкций, позволяющее повысить их биологическую активность.
Так, содержащий VEGF биомиметический слой, состоящий из композита гидроксиапатита и коллагена, костноза- мещающих скаффолдов характеризовался усилением процессов ангиогенеза и остеогенеза в ишемизированных условиях (in vivo) по сравнению со скаффол- дами, не нагруженными VEGF [49].
Очень хорошие результаты (in vivo) показала клеточно-тканевая конструкция для восстановления больших полостей поражения после пересечения спинного мозга на основе фибрина с «коктейлем» из ростовых факторов, в том числе IGF, bFGF, EGF, PDGF, HGF. В области поражения эта конструкция с высеянными в нее нейральными стволовыми клетками обеспечивала их высокую выживаемость и дифференцировку в клетки глии и нейроны с множественными развитыми аксонами [50].
Введение отдельных факторов в состав скаф- фолдов может быть хорошим подходом для исследования влияния изменений биофизических свойств внеклеточного матрикса на процессы жизнедеятельности клеток (миграцию, рост, пролиферацию) и выявления механизмов, обуславливающих процессы формирования экзогенной ткани.
Однако, несмотря на довольно хорошие результаты использования отдельных факторов роста и их «коктейлей» в тканевой инженерии, следует отметить, что единичные факторы роста не всегда могут обеспечить достаточные условия для нормального роста, пролиферации и направленной дифференцировки клеток, а подбор оптимального композита из отдельных факторов - достаточно сложный и дорогостоящий процесс. Хорошим примером может служить работа по моделированию васкулогенеза in vitro в бессывороточных условиях с использованием эндотелиальных клеток и перицитов, помещенных в фибриновый скаффолд. Было показано, что в присутствии «коктейля» из цитокинов, гемопоэтических стволовых клеток и FGF- 2, эндотелиальные клетки формировали трубки, что сопровождалось привлечением перицитов на аблюмнальную поверхность этих трубок. В то же время при использовании «коктейля» из VEGF и FGF-2 подобного морфогенного ответа не наблюдалось [51].
В связи с вышесказанным, интересны работы, в которых для функционализации синтетических скаффолдов используют выделенные из крови тромбоциты, содержащие комплекс ростовых, про- и ангиогенных факторов, высвобождающихся непосредственно в клеточно-инженерной конструкции. Например, тромбоциты, иммобилизованные на поверхность нановолокон скаффолда из поликапролактона, способствовали распространению, пролиферации и высокой метаболической активности таких клеток, как фибробласты, кератиноциты и меланоциты [52].
Наибольшее распространение в тканевой инженерии получили продукты из обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). PRP используют в качестве основного материала и как компонент композита в составе скаффолдов [53, 54].
Скаффолды с использованием PRP разрабатываются для различных областей медицины: стоматологии, кардиохирургии, офтальмологии, травматологии и ортопедии. Популярность PRP обусловлена прежде всего ее составом и свойствами. Она содержит все плазменные компоненты, включая фибриноген, фибронектин, фактор XIII, которые позволяют формировать биологически активную клеточную матрицу и обеспечивать питание клеток. В составе PRP имеются тромбоциты, снабжающие скаффолд различными факторами, высвобождаемыми при полимеризации и повышающими регенеративный и ангиогенный потенциал клеточно-инженерной конструкции [55]. Однако, несмотря на исследования in vitro и положительные теоретические обоснования, использование PRP in vivo может привести не только к отсутствию положительного эффекта, но иногда даже к отрицательному влиянию на процесс регенерации ткани. Так, например, было показано, что при имплантации коллаген-гидроксиапатитного скаффолда, нагруженного аутологичной PRP, у овец с смоделированным остеохондральным поражением бедренного мыщелка наблюдалась неполная регенерация кости и формирование высокоаморфной хрящевой ткани со слабой пространственной организацией.
При этом у овец с таким же скаффолдом, но без PRP регенерация костной ткани и реконструкция поверхности хряща были значительно лучше [56]. Причины подобных расхождений в теоретических предпосылках, результатах in vitro и in vivo пока не ясны. Есть мнение, что отчасти они могут быть связаны с использованием различных методов приготовления и обработки PRP, а так же значительной изменчивостью качества PRP среди доноров. клеточный скаффолд кровь биологический
Один из путей решения возникающей проблемы стандартизации - это использование лизата пула тромбоцитов, выделенных из PRP нескольких доноров. Так, in vivo показана возможность использования гидрогеля на основе лизата тромбоцитов, полученного из PRP нескольких доноров, в качестве носителя для доставки клеток в участки поврежденных тканей, обладающего высоким ангиогенным потенциалом.
Последний, по мнению авторов, связан с кинетикой высвобождения факторов роста, определяемой микроструктурой скаффолда из PRP, отличной от микроструктуры простого фибринового скаффолда [57]. Также лизат пула тромбоцитов от нескольких доноров достаточно широко используют в композиции с другими материалами для повышения их биологической активности.
Например, покрытие гидроксиапатитных трикальциево-фосфатных скаффолдов факторами роста лизата тромбоцитов индуцировало продуцирование и секрецию проангиогенных белков (плацентарного фактора роста и сосудистого эндотелиального фактора роста) MSC. Эти белки обеспечивали пролиферацию и специфическую миграцию эндотелиальных клеток in vitro, улучшая тем самым неоваскуляризацию и формирование новой костной ткани in vivo [58].
Полисахаридный полиуретан-по- лидиметилсилоксано-фибриновый скаффолд, нагруженный лизатом тромбоцитов in vitro, обеспечивал рост клеток, сопоставимый с тем, который наблюдался при добавлении лизата тромбоцитов в культуральную среду. Это, по мнению авторов, было связано с замедленным высвобождением факторов роста из скаффолда. Этот же скаффолд in vivo ускорял заживление глубоких обширных кожных раневых дефектов, смоделированных на мышах [59].
Таким образом, лизат тромбоцитов представляется перспективным продуктом, способным обеспечить рост, пролиферацию и дифференцировку клеток в составе скаффолдов, а также увеличить проангиогенный потенциал клеточно-инженерных конструкций. В то же время для минимизации расхождений между результатами доклинических исследований и последующим клиническим результатом необходимо выработать методы стандартизации как в отношении исходного материала (PRP), так и конечного продукта (лизата тромбоцитов).