Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр
Использование компонентов крови в тканевой инженерии
М. Н.Егорихина
Нижний Новгород
Резюме.
Обзор показывает состояние научных исследований в области использования наиболее востребованных с точки зрения тканевой инженерии и регенеративной медицины компонентов крови в качестве материалов для создания скаффолдов. Проанализированы данные исследований структуры и свойств скаффолдов, активности клеточных процессов, проангиогенного потенциала клеточных матриц обусловленные свойствами различных компонентов крови в их составе.
Показана взаимосвязь механических свойств, состава, структуры и активности клеточных процессов в скаффолдах на основе компонентов крови. Рассмотрены механизмы влияющие на регенеративный потенциал скаффолдов обусловленные свойствами различных компонентов крови входящих в их состав.
Ключевые слова: тканевая инженерия, биоматериалы, скаффолды, компоненты крови, клетки, ангиогенез, регенерация.
Конфликт интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Abstract
The use of blood components in tissue engineering
M. N. Egorikhina. Privolzhsky Federal Research Medical Centre, Nizhny Novgorod
The review shows the state of scientific research in the field of the most demanded components of blood usage as the materials for creating scaffolds from the point of view of tissue engineering and regenerative medicine. The data of studies concerning the structure and properties of scaffolds, the activity of cellular processes, the proangiogenic potential of cell matrices due to the properties of various blood components in their composition are analysed. The interrelation of mechanical properties, composition, structure and activity of cellular processes in scaffolds on the basis of blood components are shown. The mechanisms influencing the regenerative potential of scaffolds due to the properties of various components of blood in their composition are considered.
Key words: tissue engineering, biomaterials, scaffolds, blood components, cells, angiogenesis, regeneration.
Введение
Растущая потребность в разработке новых тканезамещающих материалов для восстановления поврежденных тканей и органов является одной из наиболее актуальных проблем в современной медицине. Решение этой проблемы лежит в области тканевой инженерии и связано с созданием клеточных матриц (скаффолдов), способных обеспечить достаточную временную механическую поддержку для развития ткани, создать условия для метаболизма клеток, возможности васкуляризации и ремоделирования регенерирующей ткани.
К материалам, на основе которых создаются скаффолды, предъявляется ряд требований: биосовместимость, биорезорбируемость, неток- сичность, низкая иммуногенность [1].
Они должны позволять создавать трехмерную пористую структуру, сходную с естественным внеклеточным матриксом, удерживать достаточно большое количество воды для обмена питательными веществами и продуктами жизнедеятельности между клетками, обладать биологической активностью, чтобы обеспечить образование адгезионных комплексов между клетками и внеклеточным матриксом и, таким образом, через интегрины активировать определенные внутриклеточные сигнальные пути, которые, в конечном счете, регулируют развитие ткани [2].
Достаточно широко распространенными и доступными материалами, отвечающими вышеперечисленным требованиям, являются компоненты крови. Они представляет собой уникальный материал с точки зрения тканевой инженерии.
В плазме крови есть белки, способные образовывать нановолокнистые полимеры и имеющие активные центры взаимодействия с интегринами клеток, которые остаются доступными и после полимеризации.
Плазма крови и обогащенная тромбоцитами плазма содержат множество питательных веществ и факторов роста, наличие которых может обуславливать нормальную жизнедеятельность клеток в структуре скаффолда. Все это создает предпосылки для разработки клеточно-инженерных конструкций на основе компонентов крови с необходимыми физико-механическими и биологическими свойствами. В представленном обзоре рассмотрены вопросы, связанные со свойствами наиболее востребованных компонентов крови с точки зрения тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Фибриноген /фибрин
Фибриноген - белок крови, концентрация которого в плазме у здоровых людей составляет 1,7-4,0 г/л. Фибриноген имеет простые свойства гелеобразования при непосредственном взаимодействии фибриногена и тромбина. Под действием тромбина происходит переход растворимых молекул фибриногена в нерастворимые с образованием полимерной сети в виде геля (сгустка фибрина).
Тромбин расщепляет аминотерминальные окончания а- и ^-цепочек фибриногена, в результате чего появляются фибрин-мономеры. Они, спонтанно полимеризуясь, формируют протофибриллы фибрина, которые, взаимодействуя друг с другом, образуют нити фибрина, формирующие фибриновую сеть [3].
Последняя имеет нанометрическую волокнистую структуру с высоким отношением площади и объема, имитируя естественный внеклеточный матрикс [4]. Более того, фибриновая сеть, являясь естественной ранозаживляющей матрицей, обеспечивает трехмерный каркас для клеток, их миграцию и адгезию в область раны. Это служит одной из основных предпосылок широкого использования гидрогелей на основе фибрина в качестве клеточных матриц (скаффолдов) для регенерации различных типов ткани.
Известно, что самосборка фибриновых волокон зависит от концентрации фибриногена, тромбина и кальция, а также других белков. При этом формирующаяся фибриллярная сеть может иметь различную плотность и толщину фибрилл.
Так, при высоких концентрациях тромбина, образуется плотная сетка из тонких пучков тонких фибриллярных волокон. При уменьшении концентрации тромбина, взаимодействующего с таким же количеством фибриногена, средний размер пучка волокон увеличивается, и фибриновая матрица становится более пористой [5], но при этом толстые волокна имеют меньше боковых ответвлений по сравнению с тонкими [6]. Катионы кальция, подобно тромбину, влияют на структуру фибриллярной сети.
Однако к увеличению толщины волокон и размера пор приводит не уменьшение, а увеличение концентрации кальция относительно фибриногена [7]. В ряде исследований показано, что микроструктура фибриновой матрицы оказывает непосредственное влияние на клеточную адгезию, миграцию и пролиферацию [7-9]. При этом увеличение плотности фибриллярной сети, как правило, приводит к снижению активности клеточных процессов.
В то же время, размер волокон и плотность фибриллярной сети фибрина имеют высокую корреляцию с механическими свойствами фибринового сгустка [10], составляющего основу скаффолдов из плазмы крови. Это приводит к проблеме выбора между оптимизацией структуры фибриновой сети для клеток или смещением ее свойств в сторону обеспечения механической прочности скаффолда. Попытки решения данной проблемы часто связаны с введением в состав скаффолдов дополнительных компонентов (глутарового альдегида, гинепина и др.), обеспечивающих стабилизацию структуры и механическую прочность конструкций на основе фибрина путем дополнительной сшивки белков [11, 12].
Использование плазмы крови, а не чистого фибриногена, в качестве материала для фибриновых скаффолдов, в определенной мере позволяет улучшить его механические свойства за счет ее естественных компонентов.
Известно, что в плазме крови содержится фактор XIII (Х111а), который катализирует образование у-глутамилелизил амидной связи между мономерами фибрина и таким образом стабилизирует его полимеры, повышая прочностные свойства фибриновой матрицы [13].
XIII фактор также используется и при создании скаффолдов из чистого фибриногена [14]. Введение стабилизирующих веществ, улучшающих механические свойства конструкций на основе фибриногена, изменяет микроструктуру фибриновой сети и может также приводить к замедлению роста и пролиферации клеток. В частности, пэгилирование фибриногена приводит к повышению плотности фибриллярной сети и имеет дозозависимый характер. Образующаяся при использовании высоких доз полиэтиленгликоля структура фибриллярной сети замедляет рост, распластывание и образование межклеточных контактов эндотелиальных и стволовых клеток [15].
На основании этих и дополнительных данных о метаболической активности клеток авторы делают вывод о том, что структура фибриллярной сети может изменять васкуляризацию клеточно-инженерных конструкций. Влияние микроструктуры фибрина на ангиогенез подтверждается и рядом других исследований [4, 16].
Еще один вариант повышения механических свойств скаффолдов - это введение в их состав компонентов выполняющих армирующую функцию как без изменения [17], так и с модификацией [18] структуры фибриновых волокон.
В качестве примера можно привести работу С. М. Brougham et al. [19], установивших, что усиление фибрина коллаген-гликозаминогликановой системообразующей структурой приводит к значительному увеличению модулей сжатия и упругости скаффолда по сравнению с фибриновым гелем.
В настоящее время накапливается все больше данных о значительном разнообразии механизмов влияния фибрногена/фибрина на ангиогенез. При этом установлено, что ангиогенный потенциал фибриновой матрицы обусловлен не только ее микроструктурой, но и наличием активных центров взаимодействия в молекуле фибриногена/фибрина с интегринами клеток. Известно, что в фибриногене имеется ряд RGD-последовательностей, взаимодействующих с интегриновыми рецепторами клеток.
Так, RGD-последовательность 572-574 в Aa-цепи человеческого фибриногена взаимодействует с avb3- avb5- и a5b1 интегринами эндотелиальных клеток и играет важную роль в их адгезии, миграции и способности формировать трубчатые структуры в фибриновой матрице [20-22]. Еще один механизм, обеспечивающий ангиогенный потенциал фибрина, связан с одним из продуктов его ферментативного расщепления, которое наблюдается в зонах активного образования новых кровеносных сосудов, - фрагментом Е.
Показано, что фрагмент Е стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку эндотелиальных клеток [23].
Достаточно широкий интерес исследователей в области тканевой инженерии вызывает способность фибриновой матрицы выступать в качестве естественного носителя клеточных белковых факторов.
Известно, что фибриноген может связывать многие биологически активные белки, такие как фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующий ростовой фактор бета (TGF-в), тромбоспондин-1 (TSP1), интерликин-1(1Ь1), которые высвобождаются после его полимеризации [24-27]. В работе E. Hadjipanayi et al. [28] показано, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и тромбоцитарный фактор (PF4), являющиеся ключевыми про- и антиангиогенными факторами, дифференциально связаны с матрицей фибрина.
При этом матрица может осуществлять биохимический контроль ангиогенеза путем уравновешивания относительных концентраций и контролируемого массзависимого высвобождения про- и антиангиогенных факторов.
Таким образом, способность фибриногена/ фибрина связывать и высвобождать белковые факторы может обеспечить долговременную регуляцию клеточных ответов в скаффолде, что является предпосылкой для формирования пространственно-обусловленного ангиогенеза.
Еще одно привлекательное свойство конструкций на основе фибрина - это возможность создания материла с контролируемой биодеградацией. Это позволяет адаптировать скаффолд прежде всего с точки зрения функции структурной поддержки в отношении развивающихся тканей.
Так, например, скорость деградации фибринового геля можно регулировать путем изменения микроструктуры фибриллярной сети или введением дополнительных агентов, таких как апротинин и транексамовая кислота (транс-4-амино- метилциклогексан-1-карбоновая кислота, 1АМСА), что позволяет добиться соответствия этого процесса естественно протекающей регенерации тканей [7, 29].
Фибронектин
Фибронектин - еще один биополимер, достаточно широко используемый при разработке скаффолдов. Интерес к фибронектину, как к перспективному компоненту искусственных клеточно-инженерных конструкций, связан с уникальными функциональными свойствами данного белка, входящего в состав естественных внеклеточных матриксов тканей и продуцируемого самими клетками.
Фибронектин является наиболее распространенным белком, способным формировать уникальную фибриллярную сеть. В нерастворимой форме он входит в структуру многих тканей, а его растворимая форма содержится в достаточно большем количестве в плазме крови.
Фибронектин представляет собой димерный белок, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками у С-концов. Благодаря своей структуре, он способен связывать коллаген, протеогликаны, гиалуроновую кислоту, углеводы плазматических мембран, гепарин, фермент трансглутаминазу и, соответственно, может выполнять интегрирующую функцию в организации межклеточного вещества [30, 31].
Также известно, что наличие в молекуле фибронектина центров связывания с интегринами клеточных мембран способствует увеличению клеточной адгезии.
Одним из основных свойств, обуславливающих включение фибронектина в состав скаффолдов, является потенциирование сигналов, контролирующих пролиферацию и дифференцировку клеток, а также сигналов, способных обуславливать васкуляризацию скаффолдов.