Материал: Использование жидкостной хроматографии для контроля качества лекарственных средств, применяемых в медицине

Использование жидкостной хроматографии для контроля качества лекарственных средств, применяемых в медицине

Введение

В настоящее время в мире используется большое количество лекарственных препаратов, в связи с этим, самая важная задача фармацевтической химии - надежный и точный (качественный, количественный) анализ веществ, входящих в состав препаратов. Одним из способов установления качественного и количественного состава лекарственного препарата являются хроматографические методы анализа, которые позволяют также разделять сложные смеси, а именно жидкостная хроматография.

Вопросы контроля качества и стандартизации лекарственных средств усиливают свою актуальность в настоящее время в связи с общим увеличением числа зарегистрированных лекарственных средств, поступающих, как правило, от разных производителей.

Цели курсовой работы: проведение анализа жидкостной хроматографии и установление целесообразности использования для контроля качества лекарственных средств.

Основные задачи: обобщить и проанализировать возможность использования жидкостной хроматографии для контроля качества лекарственных средств, применяемых в медицине.

жидкостный хроматография лекарственный

1. Жидкостная хроматография (ЖХ)

Жидкостная хроматография - это физико-химический процесс, суть которого заключается в различии скоростей перемещения компонентов смеси подвижной и неподвижной фазы в связи с отличающимися силами адсорбции, сил Ван-дер-ваальса, динамики процессов сорбции и десорбции в системе.

В простейшем виде хроматографическое разделение смеси осуществляется при прохождении потока жидкости (подвижной фазы), содержащего анализируемые вещества, через колонку, заполненную сорбентом (неподвижной фазой). Если молекулы разных компонентов разделяемой смеси обладают различной адсорбируемостью или растворимостью, то время их пребывания в неподвижной фазе, а следовательно, и средняя скорость передвижения по колонке различны. При достаточной длине колонки это различие может привести к полному разделению смеси на составляющие ее компоненты. После ввода анализируемой смеси с потоком подвижной фазы в колонку зоны всех веществ расположены в начале хроматографической колонки. Под действием потока подвижной фазы компоненты смеси начинают перемещаться вдоль колонки с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициентам распределения К (или константам распределения) хроматографируемых компонентов. Хорошо сорбируемые вещества, значения констант распределения для которых велики, передвигаются вдоль слоя сорбента по колонке медленнее, чем плохо сорбируемые. Поэтому быстрее всех из колонки выходит компонент А, затем компонент Б и последним покидает колонку компонент В (КА<КБ<КВ). [1,2,18]

2. Классификация жидкостной хроматографии

По агрегатному состоянию фаз хроматографической системы методы жидкостной хроматографии классифицируют на жидкостно-адсорбционную, жидкостно-жидкостную и противоточную жидкостную хроматографию.

По способу перемещения сорбата различают следующие виды жидкостной хроматографии: вытеснительная, фронтальная, элюентная, изократическая, градиентная, с программированием температуры, давления и скорости потока элюента.

По конфигурации разделяющей системы выделяют планарную (бумажную, тонкослойную), колоночную, микроколоночную, многоколоночную, циркуляционную, многомерную, перколяционную хроматографию и мультихроматографию.

По относительной полярности подвижной и неподвижной фаз различают нормально- и обращенно-фазовую жидкостную хроматографию.

По механизму разделения выделяют адсорбционную, распределительную, эксклюзионную, афинную, лигандообменную, ионообменную и другие виды жидкостной хроматографии.

По цели и задачам можно выделить аналитическую, препаративную и обращенную ситовую хроматографию.

По химическому превращению сорбата выделяют реакционную и осадочную хроматографию.

По способу детектирования различают хроматографические методы сочетающие разделение компонентов смеси с прямым детектированием веществ оптическими детекторами, работающими в ультрафиолетовой, видимой, инфракрасной области, рефрактометрическими, эмиссионными, флуориметрическими, хемилюминесцентными, электрохимическими и другими детекторами.[3,8,25]

3. Определения, относящиеся к области жидкостной хроматографии

Хроматография - метод разделения смесей веществ или частиц основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Колонка - содержит хроматографический сорбент, выполняет функцию разделения смеси на индивидуальные компоненты.

Элюент - подвижная фаза (растворитель или смесь растворителей): жидкость или (реже) сверхкритический флюид.

Неподвижная фаза - твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, в адсорбционной хроматографии - сорбент.

Хроматограмма - результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.

Детектор - устройство для регистрации концентрации компонентов смеси на выходе из колонки.

Хроматограф - прибор для проведения хроматографии.[1,2,22,24]

Критерии пригодности хроматографической системы - это ряд диапазонов допустимого изменения параметров хроматограммы, соблюдение которых, по мнению разработчика, необходимо для успешного прохождения процедуры валидации методики. К параметрам хроматограммы относятся величины, характеризующие хроматографическое разделение: разрешение R (для пары пиков), селективность α (для пары пиков), фактор удерживания k’ (для определенного пика), эффективность N (по определенному пику с определенным фактором удерживания), коэффициент асимметрии Ka (для определенного пика). Выполнение критериев пригодности хроматографической системы - это необходимое условие успешного прохождения процедуры валидации, но еще не достаточное.

По "правилам хорошего тона" разработчик методики должен не только указать критерии пригодности хроматографической системы, но и объяснить в деталях, как каждый из критериев рассчитывается.[7,9,21]

. Определения и расчёты общих параметров и применимых ко всем хроматографическим методам требований для пригодности системы

Параметры удерживания

Время удерживания и удерживаемый объём

Измерения удерживания в элюентной хроматографии могут быть представлены временем удерживания (tR), определённом непосредственно по положению максимума пика на хроматограмме. Из времени удерживания может быть рассчитан удерживаемый объём (VR).

V_R = t_Rv

tR - время удерживания или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту, v - объёмная скорость подвижной фазы.

Концентрационный коэффициент распределения.

Концентрационный коэффициент распределения (Dm) (также известный как коэффициент ёмкости к' или фактор удерживания k) определяется как:

D_m = (количество вещества в неподвижной фазе) / (количество вещества в подвижной фазе)

K_c =  V_S / V_M

K_c - коэффициент распределения,

V_s - объём неподвижной фазы,

V_M - объём подвижной фазы.

Значение D_m компонента может быть определено из хроматограммы при использовании выражения:

Dm = tR-tM / tM

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту,

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

Коэффициент распределения.

Характеристика элюирования в эксклюзионной хроматографии может быть представлена коэффициентом распределения (K0), который рассчитывают с помощью выражения:

^K о = (^tR ^t о) / (^tt ^t о)

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту,

t0 - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту,

tt - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту, который полностью проникает в поры неподвижной фазы.

Фактор удерживания (подвижности)

Фактор удерживания (подвижности R_F ), используемый в плоскостной хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы.

R_F = b/a

b - расстояние, пройденное веществом,

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

Хроматографические параметры.

Пик может быть охарактеризован площадью пика (A) или высотой пика (h) и шириной пика на половине высоты (w_h) или высотой пика (h) и шириной пика между точками перегиба (w). Для гауссовских пиков справедливо соотношение:

w_h = 1,18 w_t

Фактор асимметрии.

Фактор асимметрии пика (A_s) (Рисунок 2.2.46.-2) рассчитывается из выражения:

A s = w0,05 / 2d

wo,o5 - ширина пика на одной двадцатой высоты,

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика и передним краем пика на одной двадцатой высоты.

Если фактор ассиметрии равен 1,0 - это означает полную (идеальную) симметрию.

Параметры разделения.

Разрешение

Разрешение (R_s) близких по высоте пиков двух компонентов может быть рассчитано из выражения:

1>tR2

t_Ri и t_R2 - времена удерживания или расстояния, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков,

w_h1 и w_h2 - ширина пиков на половине высоты.

Разрешение более 1,5 соответствует разделению пиков до базовой линии.

Выражение, приведенное выше, не может быть использовано в случае, когда пики сильно различаются по высоте.

В количественной плоскостной хроматографии вместо времён удерживания используются пройденные расстояния, и разрешение может быть рассчитано с использованием выражения:

R = 8a(R_Pl -R_Pl) / (Wh1+Wh2)

R_F1 и R_F2 - отношения расстояний от точки нанесения пробы до центров пятен и расстояния, прошедшего фронтом растворителя от точки нанесения пробы (фактор подвижности),

w_h1 и w_h2- ширина пиков на половине высоты,

а - расстояние, прошедшее фронтом растворителя.

Коэффициент разделения пиков.

Коэффициент разделения неполностью разделённых пиков (p/v-параметр) может быть использован в качестве требования пригодности хроматографической системы при выполнении испытания на родственные соединения в случае неполного отделения примеси от анализируемого вещества (аналита).

p / v = Hp / Hv

Hp - высота пика примеси относительно экстраполированной базовой линии,

Относительное удерживание.

Относительное удерживание (г) рассчитывается из выражения:

Hv - расстояние между экстраполированной базовой линией и нижней точкой

tR₂ *t _м1 r = 1 / (tR1 - tM)

t_R2 - время удерживания интересующего пика,

t_R1 - время удерживания пика сравнения (обычно пик, соответствующий исследуемому веществу),

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

В плоскостной хроматографии вместо tr2 и tr1 используются факторы подвижности

Отношение сигнал/шум (S/N) влияет на воспроизводимость (прецизионность) количественного определения и рассчитывается из уравнения:

S /N = 2H/h

H - высота пика, соответствующая рассматриваемому компоненту, на хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного раствора сравнения, измеренная от максимума пика до экстраполированной базовой линии для сигнала, величина которого эквивалентна двадцатикратному превышению величины ширины пика на половине высоты,

h - размах для фонового шума (уровень шума) на хроматограмме, полученной при введении или нанесении холостой пробы, величина которого эквивалентна двадцатикратному превышению щирины пика на половине высоты для пика на хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного раствора сравнения и, если возможно, расположенного на одном и том же расстоянии от места возможного обнаружения пика.

Сходимость (повторность) отклика выражается в виде рассчитанного процентного относительного стандартного отклонения (RSD, %) последовательных серий измерений с участием исследуемой пробы или раствора сравнения.

у1 - индивидуальное значение площади пика, высоты пика или отношения площадей методе внутреннего стандарта.

у - среднее индивидуальное значение.

п - число индивидуальных значений.

Пригодность системы

Тесты на определение пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для того, чтобы удостовериться в адекватном функционировании хроматографической системы. Для оценки работы колонки обычно используются следующие параметры: эффективность, концентрационный коэффициент распределения, разрешение, относительное удерживание и фактор асимметрии.

На хроматографическое поведение могут влиять такие факторы, как состав, ионная сила, температура и рН подвижной фазы, скорость потока, длина колонки, температура, давление, а также характеристики неподвижной фазы: пористость, размер частиц, удельная площадь поверхности, а в случае обращённой фазы степень химической модификации (блокирование концевых групп, число атомов углерода и т.д.).

Различные компоненты используемого оборудования должны быть проверены на соответствие их качества и должны обладать точностью измерений требуемой для проведения испытания или количественного определения.

Должны быть соблюдены следующие требования при отсутствии других указаний в частной статье.

· Величина фактора асимметрии основного пика должна находиться в пределах от 0,8 до 1,5, если только нет иных указаний в частной статье. Данное требование распространяется как на тесты, так и на количественные определения, описанные в частных статьях.

· Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение для повторных измерений для предписанного раствора сравнения не должно превышать величин, приведенных в государственной фармакопее. Данное требование распространяется только на количественное определение вещества и не используется в случае проведения испытания на родственные соединения.