Статья: Инновационное свойство окрашенных веществ: красители и пигменты в фотодинамическом методе лечения онкологических заболеваний

Рисунок 7. - Дифференциальная светопроницаемость кожи.

Как видно, наиболее глубоко проникают под кожу (и то только на 1-2 см) красные лучи (600-700 нм) и ближние инфракрасные. Из этой схемы следует, что если нужно "выжигать" опухоль на глубине 1-2 см, то предпочтительней выбирать окрашенное вещество, поглощающее красный свет (синие красители). Если лечению подвергают кожные заболевания, то можно использовать вещества, поглощающие в желтой области или в ближнем ультрафиолете (295-400 нм). Наиболее сложно освещать опухоли внутренних органов, куда свет подводят от лазера с определенной длинной волны излучения с помощью световодов.

В нашей работе для аппликационной технологии выбрали один из самых первых [10] окрашенных веществ - фотосензибилизаторов Метиленовый синий, по химической классификации относящийся к тиазиновым (сера в цикле), а по технической классификации к основным (катионным) красителям - основной синий 9 по Colour Index (рис.8).

Рисунок 8. - Структурная формула метиленового синего.

Этот краситель одним из первых начали применять в медицинской практике в различных терапевтических целях: в начале 19 века в качестве противомалярийного средства, для местной дезинфекции против бактерий, лечения кожных заболеваний, туберкулеза. Бактерицидное действие Метиленового Синего, как соединения катионной природы [11], усиливается его фотоактивностью и способностью генерировать синглетный кислород. Как катион, он по определению является бактерицидом даже без облучения, а последнее приводит к эффекту фотодинамического антибактериального действия. При этом в случае необходимости борьбы с кожной инфекцией достаточно просто действие солнечного света. Метиленовый Синий убивает и грамположительные и грамотрицательные патогенные микробы. При использовании Метиленового Синего и других тиазиновых красителей (как и других органических окрашенных соединений) в борьбе с инфекцией при облучении они дают хороший эффект и при этом в отличие от антибиотиков не происходит привыкания к ним микроорганизмов.

МЕТОДОЛОГИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе изучалось в условиях аппликационной технологии лечения фотодинамическое действие Метиленового Синего в сравнении с современным препаратом-фотосенсибилизатором Фотосенсом (рис.8) [12] и с известным генератором синглетного кислорода - красителем Бенгальским розовым (рис.9) [2].

Рисунок 9. - Химическое строение Фотосенса и Бенгальского розового.

Фотосенс - тиазиновый кислотный по технической и фталоцианиновый по химической классификации [2].

Наблюдая положительный лечебный эффект Метиленового Синего и Фотосенса, видимо суммарного эффекта от генерации синглетного кислорода и радикалов, мы попытались разделить эти два деструктирующих злокачественную опухоль механизма. Методически это очень сложно, т.к. большинство фотосенсибилизаторов действуют по смешанному механизму, генерируя оба вида супер активных частиц [6].

Методология [13] подобных исследований сводится к следующему:

выбирают специальные препараты, играющие роль доноров или акцепторов радикалов или синглетного кислорода и вводят их в систему (жидкая, твердая), содержащую фотосенсибилизатор и наблюдают кинетику генерации и расхода активных частиц и фотосенсибилизатора.

Изменение скоростей реакции и квантовых выходов позволяет делать определенные выводы о роли активных частиц в фотохимических превращениях.

В качестве модели белка нами был выбран раствор коллагена, как одного из главных компонентов тканей и кожи. Коллаген в форме раствора в концентрации 0,8% по сухому веществу с рН=4 доводили до рН=7-8, что соответствует рН кожи человека.

Второй моделью белка служила полиамидная пленка, как синтетическая модель белка (полиамид=синтетический полипептид).

Также были проведены опыты в жидкофазной среде этанола (хч).

В качестве ингибиторов, тушителей, акцепторов синглетного кислорода использовали диэтиленамин [6] и 1,3-дифенилизобензофуран [6].

В качестве соучастника генерации радикалов использовали аскорбиновую кислоту, способствующую радикалообразованию [5, 6] (рис.10).

Рис. 10. Аскорбиновая кислота.

Во всех случаях облучение проводили с помощью ртутной лампы высокого давления ДРШ-1000 с широким спектром излучения [1]. Облучение вели через соответствующие светофильтры.

В эксперименте с раствором коллагена ожидали, что при генерации красителями активных частиц (радикалы, 'О₂) с этим биополимером должны происходить какие-то химические и физические превращения (деструкция, сшивка, денатурация), откликом на которые должно быть изменение вязкости полимера. При этом можно ожидать, как снижения (деструкция), так и повышения (сшивка) вязкости. Возникающие радикалы могут давать и сшивку и деполимеризацию, сингелетный кислород вероятнее всего будет вызывать деструкцию.

На рис.11 показана зависимость изменения вязкости коллагена в зависимости от времени облучения в присутствии различных фотосенсибилизаторов с добавкой и без тушителя синглетного кислорода диэтиленамина (ДЭА).

Существенные изменения (повышение) вязкости коллагена при облучении происходит только в присутствии фотосенсибилизатора красителя Бенгальского Розового. В присутствии Метиленового Синего повышение вязкости коллагена не столь заметное, а Фотосенс не оказывает на вязкость при облучении никакого влияния. Коллаген в отсутствии фотосенсибилизаторов в тех же условиях облучения не изменяет свою вязкость.

Различное влияние на вязкость оказывает введенный ДЭА, как предполагаемой ловушки синглетного кислорода. В случае красителя Бенгальского Розового, известного [2], как активного генератора синглетного кислорода происходит существенное подавление роста вязкости, практически она не меняется при облучении. В случае Метиленового Синего добавка ДЭА не оказывает никакого влияния на эффект повышения вязкости при облучении красителем.

Из этих данных с определенной степенью предположительности следует, что повышение вязкости, а это может быть только следствием сшивки макромолекул полимера, происходящее под влиянием фотосенсибилизатора Бенгальского Розового и Метиленового Синего связано с генерацией активных частиц. При этом происхождение радикалов может быть не только первичным (краситель-фотосенсибилизатор), но и вторичным, т.е. генерируемый синглетный кислород через промежуточные реакции может приводить к образованию кислородсодержащих радикалов [5]. То, что Фотосенс не влияет на вязкость коллагена при облучении, видимо связано с тем, что в выбранных условиях облучения он не проявляет свою фотоактивность.

В следующем эксперименте изучали влияние при облучении трех красителей-фотосенсибилизаторов на расход акцептора синглетного кислорода - 1,3-дифенилизобензофурана в этаноле. За расходом акцептора следили по оптической плотности раствора в максимуме поглощения акцептора.

Расход акцептора означает связывание им синглетного кислорода, генерируемого красителями. Следовательно, кривые на рис.12 отражают соотношения скоростей генерации и связывания синглетного кислорода. Как можно видеть все три красителя генерируют синглетный кислород, причем на начальной фазе кинетика генерации-связывания у них очень близка, а затем Бенгальский Розовый отстает в соотношении скоростей от двух других красителей (Метиленовый Синий, Фотосенс).

Эти данные однозначно свидетельствуют о том, что в изученных системах-моделях синглетный кислород генерируется, но не исключается, что параллельно или последовательно могут возникать и радикалы различной природы.

Поскольку в медицинской практике, т.е. в фотодинамической терапии или фотодинамической диагностике фотосенсибилизаторы используются, как таковые, без добавок, то важно знать не происходит ли их разрушение под действием тех активных частиц, которые они генерируют.

На рис.13 показано влияние времени облучения на оптическую плотность трех красителей-фотосенсибилизаторов в растворе этанола. Как можно видеть оптическая плотность растворов красителей при облучении практически не изменяется, что говорит об устойчивости хромофоров красителей к синглетному кислороду и радикалам в выбранных условиях облучения. Если же в систему ввести аскорбиновую кислоту, которая способствует образованию свободных радикалов [6], то наблюдаем иную картину.

На рис.14 видно, что метиленовый синий совместно с аскорбиновой кислотой при облучении генерирует свободные радикалы, под действием которых сам же и обесцвечивается, т.е. разрушается его хромофорная часть.

Для расчета кинетических параметров изученных фотоактивных систем использовали следующую схему фотофизических и фотохимических превращений:

³S - триплетное состояние сенсибилизатора (красителя).

1/Ц_АО2=1/ЦґО₂ (1+ к_d/к_r·1/ [А]), (2)

где Ц_АО2 и Ц'О_{2 -} квантовые выходы продукта окисления АО₂ и образование 'О₂ соответственно; к_d - константа дезоктивации 'О₂; к_{r -} константа скорости реакции ингибирования синглетного кислорода акцептором; к_d/к_{r -} относительная реакционная способность акцепторов по отношению к 'О_2; А - концентрация акцепторов (к_d в этаноле=58 10^-3 с^-1, к_r в этаноле = 1 10⁹ с - ¹ [14]).

Ц_АО2 = W_абс / I_{погл (}3)

W_абс = W_отн. · С_{0 (}4)

где W_абс и W_{отн -} скорости фотохимических реакций; I_погл - скорость поглощения света; С₀ - начальная концентрация.

Квантовый выход образования 'О₂ для метиленового синего Ц'О₂ =0,51 [15, 16].

В таблице 1 представлены фотокинетические параметры (с участием кислорода) изученных систем фотопревращений для трех фотосенсибилизаторов-красителей.

Таблица 1. Фотокинетические параметры превращения красителей с участием 'О₂ при облучении