Автореферат: Индивидуальные особенности кинетики остеотропных веществ

3. Метаболизм остеотропных веществ в скелете позвоночных наследственно (семейно) обусловлен; наследственная компонента изменчивости (коэффициент внутрисемейной корреляции) обменных и морфологических характеристик экспериментальных животных находится в пределах 0,4-0,6.

4. Экзогенные воздействия (например, несбалансированная диета, ее отмена, модификация резорбции костной ткани) не влияют на величину наследственной компоненты изменчивости обмена остеотропных веществ в скелете грызунов.

Апробация материалов работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзном симпозиуме «Радиобиологический эксперимент и человек» (Москва, 1985); Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза» (Харьков, 1987); VII Всесоюзном совещании по грызунам (Нальчик, 1988); школе-семинаре «Условия содержания и разведения лабораторных животных» (Москва, 1988); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); Всесоюзной научно-практической конференции «Ускорение социально-экономического развития Урала» (Свердловск, 1989); 6-й Ростовской областной научно-практической школе-семинаре «Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды» (Ростов-на-Дону, 1990); Третьей Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск, 1990); Международной конференции «Проблемы сбалансированного развития приполярных регионов» (Сургут, 1991); совместном Советско-Американском совещании «Региональные проблемы полуострова Ямал» (Москва, 1991); межлабораторных семинарах ИЭРЖ УрО РАН (Свердловск, 1990-1991); Уральском семинаре «Экологические проблемы загрязненных радионуклидами территорий Уральского региона» (Екатеринбург, 1992); Международной радиоэкологической конференции «Экологические последствия развития ядерного комплекса на Урале: проблемы, решения» (Челябинск, 1992); Радиобиологическом съезде (Киев, 1993); 2^nd International conference «Radiobiological consequences of nuclear accidents» (Moscow, 1994); Международной научно-практической конференции «Радиационная безопасность и защита населения» (Екатеринбург, 1995); научно-практическом совещании «Новые методы исследования природных популяций» (Москва, 1995); Tenth International Congress of Radiation Research (Wьrzburg, 1995); 1 Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: риск отдалённых эффектов» (Челябинск, 1995); IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001); семинарах лаборатории экспериментальной экологии ИЭРЖ УрО РАН (1998-2001); I Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2006), семинаре отдела континентальной радиоэкологии ИЭРЖ УрО РАН (Екатеринбург, 2006).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 68 работ. Основных публикаций по теме диссертации 42, из них 2 монографии (одна из которых - коллективная), 10 статей в рекомендованном ВАК списке рецензируемых научных журналов.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, семь глав, заключение и выводы, изложена на 396 страницах, иллюстрирована 57 рисунками и включает 64 таблицы. Список цитированной литературы содержит 597 работ, из которых 246 иностранных авторов.

Содержание работы

скелет слепушонка физиологический остеотропный

Материалы и методы исследования

Основным объектом исследования служили крысы Вистар стадного разведения и инбредные мыши линий BALB/c, CBA, C57BL/6 и BC (потомство гибридов второго поколения от скрещивания животных линий BALB/c и CBA, размножавшихся в течение 10 лет путем близкородственного скрещивания и достигших состояния полного инбридинга), а также беспородные крысы и нелинейные мыши (табл. 1). Отдельные фрагменты работы выполнены на костной ткани других видов позвоночных. Также использованы животные, обитавшие на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРС) с плотностью загрязнения ⁹⁰Sr 18,5-37 МБк/м² (500-1000 Ки/км²): серые полевки (обыкновенная Microtus arvalis Pall., 1779 и узкочерепная Microtus gregalis Pall., 1779) и обыкновенные слепушонки (Ellobius talpinus Pall., 1770).

Болезненные процедуры и эвтаназию животных осуществляли под эфирным наркозом (Хельсинкская Декларация…, 1964; Проведение исследований…, 2005). Во избежание дефицита кальция и витаминов в рацион всех экспериментальных животных включали минеральную подкормку кусковым мелом и свежую зелень (в том числе при содержании животных на измененной диете).

В работе использованы общепринятые и оригинальные методы, направленные на изучение кинетики остеотропных веществ (⁹¹Y, ⁹⁰Sr, стабильного фтора, тетрациклина) в стандартных и модифицированных условиях развития животных, а также на экспериментальную оценку морфофизиологических характеристик скелета, ответственных за индивидуальные особенности обмена остеотропных веществ. Схема многих лабораторных экспериментов включала получение жизнеспособного потомства и посемейное содержание животных до половозрелого возраста (самка и ее потомство). У слепушонок также фиксировали семейную принадлежность каждого животного.

Лабораторные измерения выполнены на приборах, прошедших Государственную аттестацию ФГУ «Уралтест», радиометрию проводили с применением эталонных источников в-излучения. Проведено более 20000 радиометрических измерений и элементоопределений.

1. Определение параметров морфофизиологических факторов обмена. Исследовали физиологические (скорость аппозиционного роста и интенсивность резорбции костной ткани) и морфологические характеристики отдельных костей и целого скелета животных (площадь нативных сорбирующих поверхностей, отношение «поверхность - объем» костной ткани, иначе называемое удельной поверхностью, костный объем губчатой кости, трабекулярность кости, отношение «поверхность костной ткани - объем крови»). Выбранные характеристики наиболее значимы для обменных процессов в скелете и доступны для изучения с помощью гистоморфометрических методов (Ступаков Г.П., Воложин А.И., 1989; Родионова С.С., 2003; Meunier P.J., 2000). При этом статическая гистоморфометрия позволяет получить представления о количественных параметрах и микроархитектонике костной ткани, динамическая - об интенсивности процессов костеобразования и резорбции.

Таблица 1. Материалы и методы, использованные в работе

Интенсивность роста и резорбции костной ткани изучали в ультрафиолетовом (УФ) свете на костном (зубном) материале животных, прижизненно получивших двойную или тройную инъекцию тетрациклина (20 тыс. ед./100 г. массы тела). В УФ тетрациклиновая метка флуоресцирует ярко-желтым свечением, а интактная кость - слабо-голубым. Учитывали наличие одинарных и двойных тетрациклиновых меток, их локализацию. Одинарную метку расценивали как маркер локуса резорбции. Скорость отложения костного вещества (мкм х сут^-1) определяли как частное от деления расстояния между двумя тетрациклиновыми метками на время, прошедшее между их введением. Для перевода делений окулярмикрометра в абсолютные величины использовали объектмикрометр.

Изменение скорости перестроечных процессов в кости изучали путем совмещения двойного тетрациклинового мечения и введения модификатора резорбции (МР): крысам - паратиреоидного гормона (ПТГ), мышам - его медицинского аналога - дигидротахистерола, вызывающих усиление резорбции кости и уменьшение костеобразования.

Для определения площади костных поверхностей использовали метод коллодиевых реплик, аппроксимацию отдельных участков костей правильными геометрическими фигурами, стереологические методы.

Объем крови организма определяли методом изотопного разведения взвеси меченых ⁵¹Cr эритроцитов, вводимых животным внутривенно за сутки до умерщвления (Паркер Р. и др., 1981).

Влияние экзогенных воздействий, модифицирующих параметры скелета, изучали в модельных экспериментах. Воздействиям подвергали половозрелых или новорожденных животных, а также беременных самок, через организм которых происходит опосредованное действие на плод факторов внешней среды. В качестве воздействий на самок применены: два режима охлаждения, стрессовые по отношению к природным ситуациям; несбалансированные (в основном по содержанию Ca и белка) диеты; инъекции раствора поллютанта (фтор техногенного происхождения) и гормональных препаратов (ПТГ и АКТГ), а также химическая блокада щитовидной железы включением в диету ингибитора щитовидной железы метилтиоурацила - МТУ. У животных в постнатальном онтогенезе использовали длительную овсяную монофагию (в разные возрастные периоды и разной продолжительности), ее отмену, закрытые переломы различных костей скелета, а также модификацию резорбции.

2. Кинетические и радиометрические исследования. Радионуклиды ⁹¹Y и ⁹⁰Sr (в виде растворов солей хлористого иттрия и хлористого стронция) вводили половозрелым крысам-самцам однократно внутривенно в v. dorsalis penis, мышам - внутрибрюшинно. Применяли индикаторные количества радионуклидов, которые в 200-300 раз меньше количеств, вызывающих острые токсические эффекты (Кость и радиоактивный…, 1962; Журавлев В.Ф., 1990; Вредные химические…, 1990; Ильин Б.Н. и др., 1991), при этом дозы облучения не приводят к нарушению процессов жизнедеятельности организма (Ильин Б.Н. и др., 1991; Шибкова Д.З., 2000).

В некоторых экспериментах после введения радионуклида производили многократную прижизненную радиометрию всего тела животных. Измерения проводили на установке УМФ-1500, модифицированной для измерения активности всего тела.

При подготовке к радиометрии предварительно взвешенные органы и ткани озоляли в муфельной печи (мягкие ткани - при t = 300єC в течение 3 час, кости - t = 600єC, 5 час). Золу взвешивали. Коэффициент озоления, по которому судили о минеральной плотности костей, определяли как отношение массы золы к массе сырой кости. Из зольных остатков готовили пробы для радиометрии, которую осуществляли на счетчике «RFT 10 MHz-Zahler VAG-120». Расчет радиоактивности образцов производили методом относительного счета (% от введенного количества или% от накопленного в скелете). Для расчета абсолютной величины удельной активности (концентрации) образцов (Бк/г сырой ткани или Бк/г золы) градуировку прибора выполняли по серии калийных эталонов (Методические рекомендации, 1980).

У животных, отловленных на территории ВУРСа, определяли величину суммарной -активности скелета, в которую вносят вклад основные дозообразующие радионуклиды ⁹⁰Sr и ¹³⁷Cs (смешанный в-г-излучатель). Однако радиохимическим методом было показано, что -активность скелета обитающих здесь животных на 90-95% обусловлена ⁹⁰Sr+⁹⁰Y (Идентификация бета-излучателей…, 1996). Поэтому правомерно отождествлять величину -активности скелета и содержание в нем этих радионуклидов и для простоты изложения употреблять словосочетание «концентрация ⁹⁰Sr», подразумевая под ней суммарную -активность скелета, обусловленную ⁹⁰Sr+⁹⁰Y. Плотность загрязнения почвы ⁹⁰Sr в районе обитания слепушонок на ВУРСе производили оксалатным методом по дочернему ⁹⁰Y (Методические рекомендации, 1980).

Контактную авторадиографию продольных шлифов костей проводили на фотопластинках для ядерных исследований. Время экспозиции пропорционально экспериментально определенному: 24 часа при радиоактивности образца ~ 1000 имп. х (мин х см²)^-1 (Любашевский Н.М., Стариченко В.И., 1976).

Определение фтора в костной ткани проводили потенциометрическим методом с использованием фторселективного электрода (Определение фтора…, 1983). Концентрацию фтора выражали в мкг/г сухой кости.

3. Оценку наследственной и средовой компонент изменчивости МФФ проводили (совместно с И.А. Васильевой, А.Г. Васильевым и Н.М. Любашевским) на инбредных линейных мышах (интактных и развивающихся на фоне экзогенных воздействий в разные периоды онтогенеза). В качестве индикаторов МФФ использовали альтернативные неметрические (пороговые) признаки скелета - мелкие качественные вариации в строении черепа и отдельных костей. Производили классификацию особей на наличие того или иного признака, а потом для выборки подсчитывали частоты встречаемости каждого признака. По совокупности частот этих признаков рассчитывали фенетические дистанции (безразмерные величины) между сравниваемыми группами животных (Berry R.J., 1963; Sj?vоld T., 1973). Использован статистический метод их определения (Hartman S.E., 1980).