Реферат: Генетика пластид

Число копий молекул ДНК на пластиду колеблется. У одноклеточной водоросли хламидомонады, например, 24 - 26 копий в генеративной и вдвое больше в вегетативной клетке. У эвглены приходится около 30 копий на пластиду, а на клетку около 400 копий хлоропластной ДНК. В клетках мезофилла высших растений может содержаться от 1900 до 50 000 хпДНК (табл. 3).

Таблица 3. Максимальные количества хпДНК в листьях растений

* Поскольку у картофеля анализировали только зрелые листья, не исключено, что данный показатель у молодых листьев намного больше чем 22.

На вопрос, каков биологический смысл такого значительного количества копий хлоропластной ДНК, можно привести следующие соображения:

1. Для обеспечения репликации пластид.

Для обеспечения консерватизма генов, обеспечивающих фотосинтез.

Для быстрого запуска процесса фотосинтеза и поддержания его эффективности.

Хлоропластная ДНК и ядерная ДНК отличаются по своим физико-химическим параметрам даже у одного и того же вида.

Различия по физико-химическим свойствам ДНК свидетельствуют о различиях в их нуклеотидном составе. Определить нуклеотидный состав ДНК можно, как известно, несколькими способами. Например, прямым биохимическим анализом или определением плотности ДНК в градиенте хлористого цезия при центрифугировании или по температуре плавления. Чем выше плотность или температура плавления, тем выше процентное содержание в молекуле ДНК Г+Ц пар.

Сравнивая плавучую плотность или температуру плавления ядерной и хлоропластной ДНК, можно заключить, что процент Г+Ц пар ДНК пластид может отличаться от ядерной в одну сторону у одних видов, в другую - у других, а у третьих вообще не обнаруживают различий между хлоропластной и ядерной ДНК по этому показателю. Это, возможно, свидетельствует о том, что эволюция хлоропластной и ядерной ДНК протекает относительно независимо друг от друга. У большинства высших растений содержание Г+Ц пар находится в пределах 37-39%, однако у мха печеночника и водоросли эвглены оно значительно ниже - 32% и 25%, соответственно. В разных участках молекулы пластидной ДНК содержание Г+Ц пар также может быть различным и значительно колебаться (от 23% до 44%), что свидетельствует о внутренней гетерогенности молекулы.

Ранее считали, что хлоропластная ДНК не содержит метилированных оснований, в частности 5-метилцитозина, который содержится в митохондриальной ДНК. Сейчас известно, как минимум, два случая наличия этого редкого основания. А в хромопластной ДНК зрелых томатов, например, до 1/3 всего цитозина замещено на 5-метилцитозин. Вероятно, это механизм блокировки фотосинтеза в плодах, ускоряющий созревание плодов и семян.

При анализе кривых плавления ДНК хлоропластов было показано, что у большинства растений хлоропластная ДНК плавится как сравнительно гомогенная молекула, не содержащая различных по нуклеотидному составу участков. У некоторых водорослей определенная гетерогенность молекул ДНК хлоропластов все же обнаруживается.

Геном пластид, как водорослей, так и наземных растений представлен, как правило, кольцевой двунитевой молекулой ДНК, содержащей от 70 до 400 тысяч пар оснований (рис. 9). Хотя в основном геном пластид высших растений представлен 120-217 тысяч пар оснований.

Рис. 9. Электронная микрофотография кольцевой молекулы хпДНК подсолнечника (инбредная линия 3629).

Пластидные ДНК таких размеров способны потенциально кодировать (информационная емкость пластома) от 70 до 150 различных полипептидов. Так как хлоропласты содержат несколько сот различных белков, то большинство белков этих органелл кодируется не пластидной ДНК, а ядерной.

Изучение хлоропластного генома различных видов растений показало, что структура хлоропластного генома весьма консервативна, а генетический материал организован скорее по прокариотическому, чем эукариотическому типу.

ДНК хлоропластов не содержит большого количества высокоповторяющихся нуклеотидных последовательностей, что отличает ее от ДНК ядра. Таким образом, хлоропластный геном высоко конденсирован по сравнению с геномом ядра эукариот. В самом крайнем случае в хлоропластном геноме риса содержится не более 32% некодирующих последовательностей, а в хлоропластном геноме других видов высших растений и того меньше, в то время как в ядерной ДНК высших растений более 90% составляют некодирующие последовательности.

ДНК хлоропластов содержит рибонуклеотидные вставки. Их длина составляет от 10 до 20 нуклеотидов. У гороха, например, имеется 19 таких вставок. С помощью ДНК-ДНК гибридизации установлено, что даже у неродственных видов растений, по крайней мере, 30 % последовательности хлоропластной ДНК гомологичны. Даже геном хлоропластов эвглены, который имеет целый ряд уникальных характеристик, содержит почти полный набор тех же самых генов, что и большинство наземных растений. Консервативные последовательности распределены по молекуле вместе с дивергирующими, что, вероятно, отражает наличие кодирующих и некодирующих последовательностей. Именно кодирующие последовательности чаще всего и являются наиболее консервативными.

Обнаружено, что хлоропластная ДНК из листьев шпината существует по крайней мере в виде 4-х определенных форм с молекулярной массой моно-, ди-, три- и тетрамера.

Однако в какой бы форме не обнаруживали хлоропластную ДНК, основу ее организации составляют длинные кольцевые молекулы, содержащие всю полноту генетической информации пластид.

Хлоропластная ДНК содержит инвертированный (обратный) повтор (10-76 т.п.н.), несущий гены рРНК. Этот повтор сохраняется на протяжении более чем 400000000-летней эволюции растений. Некоторые виды бобовых Pisum sativum, Vicia faba имеют только одну его копию, а у других - Geranium - он представлен в 3-х копиях.

Рис. 10. Генетическая карта хлоропластной ДНК табака.

Геном состоит из большого - 8686 п.н. и малого -18571 п.н. однокопийных районов и двух инвертированных повторов размером 25431 п.н. каждый. Гены, изображенные внутри круга, транскрибируются по часовой стрелке, гены, изображенные снаружи - против.

В хлоропластной ДНК пшеницы, риса и клевера было обнаружено семейство диспергированных повторов. Причем, если для хпДНК злаковых описаны короткие повторы, то клевер Trifolium subterraneum является уникальным среди известных растений, размеры его повторов достигают сотен пар нуклеотидов. Интересно, что хлоропластный геном этого вида, имеющий продолжительные повторяющиеся последовательности, характеризуется и наличием многочисленных структурных перестроек.

Однако у подавляющего большинства видов высших растений хлоропластный геном несет два инвертированных повтора, между которыми расположены два однокопийных района - большой и малый (рис. 10).

В хлоропластных геномах некоторых видов обнаружены так называемые "горячие точки" - места, где перестройки последовательности ДНК происходят наиболее часто. В этих районах находят инверсии, инсерции и делеции. Если точковые мутации, чаще всего, существенно не влияют на функционирование хлоропластов, то протяженные инсерции/делеции не только влияют, но и служат, в определенной мере, дополнительным фактором видообразования. Так, при исследовании 3-х видов табака было выявлено, что вид Nicotiana acuminata имеет пластидный геном размером 171 т.п.н., другой вид - N. tabacum пластидный геном размером 160,5 т.п.н., а третий вид N. knightiana пластидный геном размеров 160,0 т.п.н. Исследования показали, что делеция 11 т.п.н. пластидного генома N. acuminata дала начало пластидному геному N. tabacum, а вторая делеция 0,5 т.п.н. у N. tabacum привела к образованию пластидного генома N. knightiana.

Было установлено, что у табака мутации происходят, в основном, в большой однокопийной области, граничащей с правым сегментом инвертированного повтора, частота же мутаций внутри повтора, как правило, невысока. Однако у Oenothera именно там обнаруживаются структурные изменения. Но это скорее исключение, чем правило.

Сходные результаты были получены и при изучении хлоропластных геномов у видов пшениц Triticum и Aegilops. В этом случае удалось показать, что делеции в геноме одного из видов Aegilops crassa привели к возникновению хлоропластных геномов двух других видов: Ае. squarrosa и Triticum aestivum. Последний вид является важнейшим хлебным злаком - мягкой пшеницей.

К середине 80-х годов целый ряд хлоропластных нуклеотидных последовательностей был идентифицирован и секвенирован. В 1986 году впервые у двух видов растений табака и маршанции японские исследователи полностью определили всю последовательность хлоропластной ДНК. В настоящее время хлоропластная ДНК полностью секвенирована у несколько десятков видов видов. Данные о полном сиквенсе геномов пластид у разных видов растений демонстрируют большое сходство их общей организации.

пластида генетика органелла мутантный

Рис. 11. Размеры и расположение основных областей хлоропластных ДНК у разных видов

R - инвертированный повтор с генами рибосомальной РНК; LSC - большая однокопийная область; SSC - малая однокопийная область.

Больше всего различий находят в размерах инвертированных повторов. У сосны черной они крайне редуцированы и составляют всего 495 пар нуклеотидов, тогда как у покрытосеменных они достигают размера от 12 т.п.о. до 25 т.п.о., что даже больше, чем размер малого однокопийного района. Инвертированные повторы у некоторых видов (эвглена, горох, бобы, люцерна) вообще отсутствуют, а у водоросли Porfira purpurea вместо инвертированного повтора присутствует прямой повтор.

Соотношение размеров большого и малого однокопийных районов также весьма изменчиво: у кукурузы, например, они различаются почти в 7 раз, тогда как у сосны черной только на 20%.

Сам по себе полный сиквенс еще не позволяет выявить гены, кодируемые ДНК пластид. До того как был сделан полный сиквенс пластидной ДНК, были построены физические карты при помощи разрезания молекулы ДНК рестриктазами и определения последовательности расположения рестриктных фрагментов. Затем на физической карте было определено положение генов, кодирующих молекулы рибосомальных и транспортных РНК пластид. Это было сделано при помощи использования меченых молекул РНК и их гибридизации с определенными рестриктными фрагментами ДНК.

Для локализации хлоропластных генов, кодирующих белки пластид, использовали определение порядка аминокислот в молекуле белка, затем синтезировали искусственный полинуклеотид, который можно использовать как зонд в гибридизации для определения участка молекулы ДНК, которая кодирует этот белок. Поскольку большинство генов, кодирующих белки пластид, достаточно консервативны, то, определив положение гена у одного вида, можно затем установить его и у другого вида. Затем, накопив достаточно большую информацию о разных генах, можно использовать компьютерную базу данных о тех или иных генетических последовательностях хпДНК и анализировать данные по полному сиквенсу ДНК.

Данные о геноме хлоропластов были получены благодаря огромному количеству самых разных экспериментов. Согласно этим данным хпДНК содержит две основных группы генов. Одна из них - это так называемые "генетические" гены, а вторая - "фотосинтетические" гены.

К первой группе относятся гены, связанные с работой генетического и белоксинтезирующего аппарата пластид.

Гены, кодирующие последовательности 4-х различных хлоропластных рибосомальных РНК.

Гены, кодирующие последовательности 30-31 хлоропластной транспортной РНК.

Гены 19 белков хлоропластных рибосом.

Полимеразные гены.

5. Гены, связанные с регуляцией экспрессии генома пластид: факторы инициации, транскрипции, элонгации.

Ко второй группе фотосинтетических генов относятся:

1. Ген большой субъединицы рибулезобифосфаткарбоксилазы/ оксигеназы.

Гены белков фотосистемы I и II.

Гены комплексов цитохромов b/f.

Гены АТФ-синтетазы.

Еще одна, третья группа генов, обнаруженная в геноме пластид, - это нуклеотидные последовательности, гомологичные последовательностям NADH-дегидрогеназе митохондрий. Показано, что эта группа генов кодирует 11 белков, входящих в состав дыхательной цепи митохондрий. Выявлено, что эти гены транскрибируются. Однако до сих пор не доказано, что в пластидах имеется полноценная дыхательная цепь.

Кроме того, в геноме пластид обнаружено около 30 неидентифици-рованных, открытых рамок считывания размером от 31 до 2136 п.н. Вероятно, это неидентифицированные гены хлоропластного генома.

Многие из кодируемых хлоропластным геномом полипептидов входят в состав сложных комплексов, в которых, по меньшей мере, один из компонентов кодируется ядром. Так, большая субъединица рубулозобифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (основного белка фотосинтеза) кодируется хлоропластным геномом, а малая - ядерным. Из восьми субъединиц АТФ-азного комплекса геномом хлоропластов кодирует только 5, а три - ядерным геномом. Из 30 полипептидов, которые идентифицированы как белки фотосистемы I и II и цитохромного комплекса, хпДНК кодирует 13, а ядерная - 6. Какая ДНК кодирует еще 21 белок, пока неизвестно.

Способность хлоропластного генома кодировать, только небольшую часть необходимых белков связана с переносом части функций в ядерный геном и установлением с ним интегративных связей.

Это предположение подтверждается рядом фактов, полученных при сравнительном изучении геномов пластид у представителей различных таксономических групп растений.