Первоначальная клетка содержит только два типа пластид: мутантные и нормальные. В качестве таких первоначальных клеток могут быть либо зиготы у видов с двуродительским наследованием пластид, либо стартовая клетка, в которой произошла мутация пластид. И в том и в другом случае мы можем получить гетеропластидную клетку.
Пропорции между мутантными и нормальными пластидами либо равные, либо преобладает один из двух типов.
Мутантные и нормальные пластиды обладают равной скоростью деления.
Мутантные и нормальные пластиды перемешиваются в стартовой клетке и во всех последующих клетках перед делением случайно и распределяются в дочерних клетках случайно.
Во всех клетках стабильное общее количество пластид.
При этих допущениях, исходя из чисто математических представлений, наступает несколько следствий:
Количество различных сочетаний мутантных и нормальных пластид в клетках тем больше, чем больше общее количество пластид на клетку.
Частота встречаемости клеток одновременно с двумя типами пластид, т.е. гетеропластидных или сортирующихся клеток, зависит от общего количества органелл, а не от стартовой пропорции мутантных и нормальных органелл.
Количество клеточных делений, приводящих к полной рассортировке мутантных и нормальных пластид на чисто мутантные и чисто нормальные ткани, равно 10 в степени n, где n - общее количество пластид. Если в клетке 2 пластиды, то через 100 клеточных делений вероятность обнаружения гетеропластидных клеток будет близка к 0.
Стадия полного завершения сортировки зависит от общего количества пластид в клетке и не зависит от стартовой пропорции нормальных и мутантных пластид. Следовательно, даже если в зиготу попадает одна отцовская на 100 материнских пластид мутантный участок ткани выщепится - хотя и небольшой.
Исходя из предложенной модели, мы вправе ожидать, что и соматическое расщепление, и наличие гетеропластидных клеток должно быть достаточно легко зарегистрировано, по крайней мере, в первом поколении после возникновения стартовой гетеропластидной клетки. В большинстве случаев наблюдения за пестролистными растениями показывают достаточно хорошее совпадение теоретически ожидаемых и практически полученных наблюдений, однако достаточно часто уже на ранних стадиях развития сортировка может заканчиваться значительно быстрее, чем, если бы мы исходили из простой математической модели. В результате этого гетеропластидные клетки иногда не удается обнаружить вообще, как и различные участки ткани. Происходит это потому, что те допущения, из которых мы исходили, не всегда справедливы.
В ряде случаев было показано, что мутантные и нормальные пластиды могут реплицироваться с разной скоростью и обладать разной жизнеспособностью, что неизбежно приведет к вытеснению одного из типов пластид из клеток и тканей. Разная реакция на свет или разная способность активно передвигаться внутри цитоплазмы клеток у мутантных и нормальных пластид может также приводить к неравномерному перемешиванию пластид перед делением клетки и неравномерному их распределению в дочерних клетках. Кроме того, количество пластид в клетках может изменяться значительно, возрастая и уменьшаясь в сотни раз в зависимости от этапа развития той или другой ткани.
Факторы внешней среды и эндогенные факторы также могут оказывать влияние на эти процессы. К числу эндогенных факторов относится, в первую очередь, действие ядерных генов. Измерить относительную скорость репликации мутантных и нормальных пластид непосредственно достаточно сложно. Однако можно использовать косвенные методы. Так, например, соотношение площадей мутантной и нормальной ткани (белой и зеленой соответственно) у потомков от скрещивания белых побегов с зелеными будет характеризовать относительную скорость размножения белых и зеленых пластид. Если при действии какого-то фактора это соотношение будет значительно и достоверно сдвинуто в ту или другую сторону, то это будет свидетельствовать о том, что данный фактор способствует репликации тех или иных пластид.
Такие опыты были проведены на герани (Pelargonium) Р.А.Е. Тилней-Бассетом в 70-е годы. Поскольку герань относится к растениям с двуродительским типом наследования пластид, использование белых и зеленых побегов пестролистных растений позволяло провести такие эксперименты. Оказалось, что пропорции между площадями белой и зеленой ткани не зависят от того, белый или зеленый побег используется в качестве материнской формы, но зависят от того, на каком ядерном генотипе происходит скрещивание. Т.е. генотип одних сортов увеличивал пропорции материнских хлоропластов, а других - наоборот - отцовских.
Таким образом, было показано, что скорость репликации тех или иных хлоропластов может зависеть от ядерных генов - одни гены способствуют более быстрой репликации материнских пластид, другие - отцовских. В результате пропорции между двумя плазматипами могут сдвигаться.
Среди разнообразных мутаций дефектов фотосинтеза описаны еще и такие, у которых дефектные пластиды наследуются как пластидные мутации, проявляя все характерные критерии нехромосомного наследования, а фактор, вызывающий эти мутации, наследуется как ядерный ген. Ядерные гены, являющиеся причиной возникновения пластидных мутаций, были названы пластидными мутаторами и обозначены как рm (от английского plastid mutator).
Наличие таких генов довольно распространено среди высших растений. Впервые они были описаны М. Роудсом у кукурузы еще в 30-х годах XX века, а впоследствии были открыты и на других растениях (ослинник, арабидопсис, петуния, рис и др.). У всех описанных видов ядерный ген мутатор наследуется как простой менделевский рецессивный ген. Рецессивные гомозиготы pmpm обычно выглядят как пестролистные растения. При их самоопылении или опылении их зелеными или пестрыми растениями возникает три типа потомков: чисто белые (они погибают на ранних стадиях развития, как неспособные к фотосинтезу), пестрые и чисто зеленые. В дальнейшем путем скрещивания можно изменять генотип пестрых растений на доминантные гомозиготы РMРМ или гетерозиготы РМрm, при этом пестролистность и способность давать три типа потомков у них сохраняется независимо от ядерного генотипа.
С другой стороны, скрещивая два зеленых растения, одно из которых гетерозиготно по генам РМрm, а другое гомозиготно pmpm, мы получаем 1/2 гетерозигот, все из которых являются зелеными и 1/2 гомозигот по рецессивным генам рm, которые могут быть как чисто зелеными, так чисто белыми, так и пестролистными (мозаичными). Такой ситуации не может быть при чисто пластидном наследовании пестролистности. Таким образом, фактор, вызывающий пластидные мутации, наследуется как менделевский рецессив, и, следовательно, расположен в ядре клетки, а сами пластидные мутации наследуются как нехромосомные гены, и скорее всего, расположены в пластидах. Как действуют гены рm, каким образом они вызывают мутации в пластидах?
Наиболее логичным предположением, которое было выдвинуто после открытия в пластидах собственной ДНК, явилось предположение о том, что ген РМ является геном пластидной ДНК полимеразы. Этот ген находится в ядре клетки, а его продукт экспортируется в пластиды. Мутантный аллель этого гена в гомозиготном состоянии производит нефункциональную ДНК полимеразу, которая вызывает ошибки при репликации пластидной ДНК, что приводит к дефектам в ДНК пластид, а затем и пластидных белках, ответственных за фотосинтез. Дальнейшие молекулярные исследования в целом подтвердили справедливость данной гипотезы. В действительности, оказалось, что в геноме хлоропластов отсутствует один из генов, кодирующих субъединицу ДНК полимеразы, необходимый для репликации ДНК пластид. Этот ген находится в ядре клетки. Кроме того, исследования пластидной и митохондриальной ДНК пестролистных мутантов показали, что в большинстве случаев гены рm вызывают разнообразные изменения именно пластидной ДНК, хотя есть пример и изменения митохондриального генома у арабидопсиса под действием этого гена. В последнем случае гены рm вызывали необратимые изменения в ДНК митохондрий, а уже изменение функционирования митохондрий приводило к дефектам фотосинтеза хлоропластов.
В целом у высших растений, несмотря на то, что исследования были ограничены главным образом только мутациями хлорофиллдефектности, удалось накопить достаточно обширный материал, позволивший охарактеризовать особенности наследования пластид и пластидных генов и даже предвосхитить некоторые открытия, сделанные впоследствии при изучении молекулярной организации генома пластид.
Одно из важнейших обобщений, которое можно было сделать при изучении формальной генетики пластид у высших растений, заключается в том, что фенотип пластид контролируется как ядерными, так и цитоплазматическими генами. Кроме взаимного контроля над фотосинтезом ядерные гены способны оказывать влияние на трансмиссию пластид в ряду клеточных поколений и половом процессе, влиять на частоту мутаций пластидных генов.
2. Геном пластид
В 1961 году X. Рис и В. Плаут обнаружили, что участок хлоропласта в одноклеточной водоросли хламидомонады окрашивается положительно по Фельгену. При электронно-микроскопическом исследовании выяснилось, что он электронно-прозрачный и содержит тонкую сеть фибрилл толщиной 25-30 А. При обработке ДНК-азой фибриллы исчезали. Это свидетельствовало о присутствии ДНК в пластидах.
Естественно, что эта основополагающая работа вызвала большой интерес и стимулировала соответствующие исследования, вследствие которых ДНК-содержащие фибриллы были обнаружены в разных типах хлоропластов, а затем и в митохондриях. Было показано наличие ДНК в хлоропластах бурых, красных водорослей, динофлагеллят, высших и низших растений. Сегодня уже молекулы ДНК выявлены более чем у тысячи видов. Затем было продемонстрировано наличие ДНК и у других типов пластид - амилопластов и хромопластов. При этом использовали разнообразные методы: радиоавтография, цитохимия, электронная микроскопия, ферментативный гидролиз и т.д.
ДНК в хлоропластах располагается в электронно-прозрачных участках. В развитых хлоропластах обычно имеется несколько таких участков (от 3-х до 8-ми), обычно они располагаются вблизи тилакоидов и часто даже ограничены тилакоидными мембранами. В лейкопластах и хромопластах эти участки более расплывчаты. В пропластидах чаще всего один такой участок и часто небольшой.
Интересно, что у динофлагеллят участок хлоропласта, содержащий ДНК, очень большой - 1,5 нм, а в покоящихся цистах он даже окружен двойной мембраной, образованной из ламелл хлоропластов и содержит маленькое концентрическое тельце, похожее на ядрышко. И это ядрышко имеет скопления рибосом.
ДНК-содержащие участки пластид похожи на нуклеоиды бактерий и не похожи на ядерный хроматин. По крайней мере, если судить по внешнему виду. В этих участках происходит синтез ДНК, РНК, рибосом.
Существует определенная связь между местом образования крахмального зерна, липидными включениями и нуклеоидом хлоропластов. Обычно синтез крахмального зерна и липидных включений происходит как раз в том месте, где имеется ДНК-содержащий участок.
У некоторых водорослей вместо нескольких нуклеоидов наблюдается длинная трубчатая структура в виде баранки, располагающаяся по периферии всего хлоропласта. Таким образом, все нуклеоиды соединены в кольцо.
У высших растений нуклеоиды чаще сферичны или линзообразны. Под действием света начинается дифференцировка пластид и вместе с этой дифференцировкой размер таких нуклеоидов увеличивается в несколько раз и содержание ДНК в них повышается. Деление нуклеоида хлоропласта протекает синхронно с делением самого хлоропласта. Нуклеоид, как и сама пластида, вытягивается, приобретает гантелевидную форму и намечается место перешнуровки. Синтез ДНК непосредственно предшествует этому процессу.
Интересно отметить, что репликация пластидной ДНК не синхронизирована с репликацией ядерной ДНК. Репликация пластидной ДНК может быть индуцирована светом.
Так же, как и у бактерий, молекулы ДНК связаны с мембраной хлоропласта. ДНК при помощи специального белка присоединена к мембране тилакоида или к окружающей мембране хлоропласта.
Когда хлоропласты разрушают при помощи осмотического шока, фракция ДНК всегда оказывается связанной с мембранами хлоропласта и освободить ее можно, только разрушив эти мембраны детергентами или обработав проназой. Вероятнее всего, что прикрепление ДНК к мембране позволяет распределять молекулы ДНК вдоль всего хлоропласта по мере роста и развития этих мембран. По аналогии с бактериальной клеткой предполагается, что мембранное прикрепление ДНК служит для сегрегации реплицирующихся молекул, в этом же месте мембраны находятся ферменты, участвующие в репликации ДНК.
Хлоропласты, как высших растений, так и водорослей содержат ДНК столько же, сколько и бактериальная клетка: 10-14 - 10-15 мг ДНК на 1 хлоропласт. В ядре клетки растений, для сравнения, ДНК на четыре порядка больше, т.е. в ядре ДНК больше в десять тысяч раз. Но поскольку ядро в клетке только одно, а хлоропластов может быть много, то общее соотношение ядерной ДНК к пластидной примерно 100 к 1. Это соотношение зависит от стадий жизненного цикла растений, т.к. в диплоидных клетках количество ядерной ДНК неизменно, а количество хлоропластной может изменяться. При старении клеток количество ДНК в пластидах может уменьшаться. Иногда находят пластиды вообще без ДНК. При переходе хлоропластов в хромопласты при осеннем старении листьев наблюдается сокращение количества ДНК на пластиду. Как функционируют пластиды, потерявшие ДНК при дифференцировке, неизвестно. Возможно, они используют генные продукты тех пластид, которые имеют ДНК.