Ферментативные методы определения концентрации магния основаны на конкретных функциональных потребностях в магнии ряда ферментов, особенно тех, которые участвуют в гликолизе и метаболизме углеводов. Например, гексокиназа использует магний-АТФ-комплекс для фосфорилирования молекул глюкозы в положении 6. Глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф) дегидрируется затем дегидрогеназой с использованием никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) окисленного, что приводит к восстановлению последнего. Количество НАДФ, продуцируемого за 15 мин, измеряется после постановки реакции с ЭДТА и определением оптической плотности при 340 нм (Tabata, 1985). Конечная абсорбция пропорциональна количеству комплекса магний-АТФ. Метод занимает много времени и не подходит для рутинного использования в клинической лаборатории, но был автоматизирован для работы в центробежном анализаторе. На точность гексокиназного метода не оказывает значительного влияния концентрация кальция до 5 ммоль/л и фосфата до 10 ммоль/л. Однако он подвержен влиянию липемии. Результаты метода очень тесно коррелируют с данными атомно-абсорбционной спектрофотометрии (г = 0,99).
Wimmer (1986) предложил быстрый метод, основанный на глицеринкиназной реакции. В нем используется реакция, катализируемая пероксидазой, для образования красного продукта, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию магния в сыворотке и оптической плотности при 510 нм. Этот метод объединяет глицеринкиназу, глицерофосфатоксидазу и пероксидазу, используя 4-аминоантипирин или 2-гидрокси-3,5-дихлорбензинсульфонат в качестве хромогена. Метод Wimmer проще автоматизировать, чем метод Tabata. Метод является линейным при концентрации магния до 2 ммоль/л и не зависит от концентрации кальция до 5 ммоль/л.
Вмешательство билирубина является обычным явлением в системах, связанных с пероксидазой, но этот метод свободен от такого вмешательства вплоть до концентрации билирубина около 350 мкмоль/л.
Метод Fossati (1989) основан на определении активности глюкокиназы (IV изотип фермента гексоки- назы). Этот фермент имеет абсолютную и конкретную потребность в активации комплексом магний-АТФ. Фермент стабилен в широком диапазоне температур и pH и доступен в чистом виде. Реакция сопровождается восстановлением НАДФ. Оптическая плотность измеряется при 340 нм. Увеличение оптической плотности пропорционально количеству активированной глюкокиназы, которое, в свою очередь, прямо пропорционально концентрации магния в образце. Этот метод является линейным до концентрации магния 2 ммоль/л в сыворотке, и его результаты тесно коррелируют с результатами атомно-абсорбционной спектрофотометрии (г = 0,99) и колориметрического метода с ксилидиловым синим (г = 0,99) в рабочем диапазоне. Метод глюкокиназы подходит для автоматизации и имеет очень хорошую точность. Глюкокиназный метод определения концентрации магния свободен от вмешательства широкого диапазона катионов, которые могут присутствовать в биологических образцах (натрия, калия, меди, кальция, железа, марганца, цинка), а также фосфата, карбоната и сульфата. На метод не влияет присутствие билирубина с концентрацией до 342 мкмоль/л или гемолиз, однако следует избегать гемолизированных образцов из-за высокого содержания магния. ЭДТА влияет на метод по очевидным причинам [13, 19].
Ферментативные методы сочетают в себе простоту фотометрических методов со спецификой атомноабсорбционной спектрометрии без необходимости использования сложного оборудования. Они обеспечивают удовлетворительную пропускную способность для большинства лабораторий и хорошие рабочие характеристики, легко автоматизируются. Ферментативные методы определения магния в меньшей степени подвержены вмешательству других катионов, белков и липемии, которые могут быть проблематичными для колориметрических систем. Ферментативные методы еще не получили широкого распространения в повседневной лабораторной практике, возможно, из-за относительного недостатка легкодоступных коммерческих наборов и высокого уровня клинической удовлетворенности колориметрическими методами [13, 14, 19].
Сложная взаимосвязь между магнием плазмы крови, плазменными белками и другими лигандами привела к появлению идеи определения содержания в биологических жидкостях ионизированного магния аналогично с кальцием, так как биологически активным является именно ионизированный кальций. Примерно 20--30 % общего магния в плазме крови связано с белками, и возможно, это происходит совместно со связыванием кальция. Разработаны простые алгоритмы для корректировки концентрации общего кальция в плазме крови с учетом содержания в ней альбумина, однако для магния таких алгоритмов не существует. Именно поэтому специалисты рекомендуют налаживать методики прямого определения концентрации ионизированного магния. Измерение концентрации ионизированного магния обычно выполняется с одновременным определением в плазме крови ионизированного натрия, калия, кальция и pH, что реализуется встроенным программным обеспечением для корректировки ионизированного магния перед отображением результата с помощью разнообразных алгоритмов. Программные алгоритмы получены экспериментальным путем с использованием водных растворов и учитывают множество факторов, влияющих на ионизированную фракцию общего магния. Принцип работы основан на селективности магнийсвязывающих лигандов, таких как ЕТН-7025. Если измерение ионизированного кальция является стабильной и зрелой технологией с четко определенными клиническими задачами, то клинический статус измерения концентрации ионизированного магния остается неопределенным. Однако, несмотря на текущие ограничения, техническая разработка магниевых электродов и поиск окончательных клинических решений продолжаются. Результаты, полученные с использованием селективных магниевых электродов, хорошо коррелируют с результатами атомно-абсорбционной спектрофотометрии. В образцах пациентов может присутствовать широкий спектр анионов (например, лактат, бикарбонат, фосфат, гепарин), которые могут снижать уровень ионизированного магния в различной степени в зависимости от концентрации. Кроме того, комплексообра- зование ионизированного магния с анионами зависит от pH и может зависеть от изменения условий in vivo на in vitro во время отбора проб, что вносит дополнительную сложность. Референсные значения сывороточного ионизированного магния, полученные этими методами, составляют 0,0554 ± 0,0570 ммоль/л для мужчин и 0,553 ± 0,053 ммоль/л для женщин. Это около 60 % общего содержания магния в плазме крови для мужчин и 62 % для женщин [13, 19, 20].
Методы измерения магния были разработаны для самых разных биологических жидкостей и тканей. На практике обычно требуется только анализ сыворотки, плазмы и мочи. В рутинной клинической практике нет значительных различий между концентрациями магния в сыворотке или гепаринизированной плазме, а контрольные диапазоны взаимозаменяемы. Цитрат - ные, ЭДТА и оксалатные антикоагулянты вызывают ложно низкие результаты в процессе хелатирования магния в образце или осаждения магния в виде соли. Желтуха и липемия могут помешать измерению магния с помощью колориметрических методов, и при оценке содержания магния в явно желтушных или гемолизированных образцах в лаборатории необходимо использовать бланк, в котором указывают на высокую вероятность погрешности, если другой образец не может быть получен [13, 19, 21].
Гемолиз представляет собой серьезную проблему для анализа содержания магния, поскольку расчетная ошибка составляет 7,6 % увеличения измеренного магния на 1 г гемоглобина. Концентрации альбумина и магния линейно связаны при высоких и низких концентрациях альбумина, но в пределах референсного интервала для альбумина результаты оценки содержания магния не зависят от концентрации альбумина. Концентрация магния в сыворотке увеличивается с задержкой отделения ее от клеток. При 4 °С задержка в разделении на 24 часа вызывает 11% увеличение измеряемой концентрации магния в сыворотке. Для клинических целей образцы крови следует брать без жгута и отделять плазму от клеток без чрезмерной задержки. Трихлоруксусная кислота, которая часто используется для разрушения эритроцитов, может ложно увеличить концентрацию магния, измеренную с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии [9, 19, 22].
При отборе пробы мочи ее следует подкислить до pH 1,0, чтобы предотвратить осаждение комплексов магния. Концентрации магния в моче, полученные в течение суток наблюдения, сильно различаются, и может потребоваться серийный сбор суточной мочи с последующим расчетом средней концентрации. Почки являются основным органом гомеостаза магния и могут уменьшить потерю элемента в периоды истощения, при условии что гомеостатические механизмы не нарушаются лекарствами, такими как нефротоксические агенты или диуретики. Потеря магния с мочой составляет приблизительно 3--5 ммоль/24 ч, но сильно варьируется и зависит от множества факторов, включая степень метаболического стресса, лекарственную терапию, статус питания и скорость метаболизма. Почки обладают способностью сохранять магний в ответ на его дефицит [9, 19].
препарат магний организм человек интенсивная терапия
Содержание магния в отдельных тканях и биологических жидкостях организма человека
Нормальное содержание общего магния в плазме крови здорового человека составляет 0,7--1,1 ммоль/л. Нормативный диапазон ионизированного магния для здоровых амбулаторных пациентов составляет 0,53-- 0,67 ммоль/л. Содержание магния в цереброспинальной жидкости приближается к 1,1 ммоль/л. Концентрация магния в эритроцитах колеблется в пределах 1,65--2,65 ммоль/л. В скелетных мышцах количество магния колеблется в пределах 7--9 ммоль/кг невысушенной ткани. Концентрация магния в плазме крови недостаточно хорошо отражает его содержание в организме в целом. Попытки осуществить эту оценку по содержанию магния в эритроцитах также потерпели неудачу. Не было обнаружено устойчивой взаимосвязи между содержанием магния в эритроцитах и в других тканях [9, 19, 21].
Внутриклеточный свободный ионизированный магний является необходимым кофактором для сотен ферментов. Обычно считается, что его концентрация достигает 1,0 ммоль/л. Свободный ионизированный магний может оказывать большое влияние на внутриклеточный метаболизм. Методология измерения свободного внутриклеточного магния была разработана Alvarez-Leefmans (1986). Широкий спектр флуоресцентных зондов, чувствительных к хелатному состоянию магния, подходит для измерения свободного магния внутри живых клеток, но ни один из них не использовался в клинической практике. Из-за склонности к образованию комплексов с АТФ для определения количества внутриклеточного магния оказалось подходящим применение магнитно-резонансной спектроскопии с радиоактивным фосфором. Обычно считается, что мононуклеарные клетки крови превосходят эритроциты для серийной оценки статуса магния у людей. Описано множество методов получения мононуклеарных клеток из периферической крови человека. Технические проблемы все еще ограничивают применение измерения внутриклеточного магния в повседневной клинической практике [19, 23, 24].
Основными веществами, связывающими ионизированный магний в клетке, являются АТФ и 2,3-дисфосфоглицерат. Общее содержание ионизированного магния в эритроцитах различных видов коррелирует с концентрациями АТФ и 2,3-дисфосфоглицерата. Клинический интерес к использованию концентраций магния в эритроцитах восходит к таким исследованиям, как работа Cox et al. 1991 г. Концентрация магния в эритроцитах была предложена в качестве индикатора общего содержания магния в организме при хронических заболеваниях, синдроме усталости, вызывающем большой профессиональный интерес. В этом исследовании магний в цельной крови и плазме измеряли с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии, а концентрацию магния в эритроцитах рассчитывали с использованием гематокритного числа. В исследовании 32 пациентов с синдромом хронической усталости уровень магния в эритроцитах, рассчитанный этим методом, оказался низким, а после внутримышечных инъекций сульфата магния было продемонстрировано клиническое улучшение. Хотя исследование вызвало значительный профессиональный и общественный интерес, результаты не были подтверждены дальнейшими исследованиями. Таким образом, роль измерения магния в эритроцитах в клинической практике остается спорной [19, 25, 26].
Целью работы Fox et al. (2007) была разработка способов измерения внутриклеточного магния в тромбоцитах. Для исследования использовалась кровь здоровых добровольцев. Плазма, обогащенная тромбоцитами, была взята из образца венепункции и пропущена через проточный цитометр. Стандартная кривая титра с использованием известных возрастающих концентраций хлорида магния была построена для каждого образца, а затем вторая половина взятых проб была обработана для измерения внутриклеточной концентрации свободного магния. Средняя концентрация свободного внутриклеточного магния составляла 0,450 ммоль/л с диапазоном от 0,204,68 до 0,674 ммоль/л. Таким образом, внутриклеточный свободный магний можно надежно и воспроизводимо измерить в тромбоцитах с помощью флуоресцентного красителя MagGreen и проточной цитометрии [27].
Что считать гипо- и гипермагниемией?
Как уже упоминалось выше, нормальная концентрация общего магния в плазме (как и в сыворотке крови) составляет в среднем 0,7--1,1 ммоль/л. Однако во множественных обзорах и представленных результатах оригинальных исследований указан более широкий диапазон нормальной концентрации общего магния в плазме крови: от 0,65 до 1,20 ммоль/л [1, 9, 14]. Graham (1960) называл нормой содержание магния в сыворотке крови в пределах 0,7--1,0 ммоль/л [28]. Fox (2001) и Elin (2010) -- концентрацию 0,65--1,05 ммоль/л [29, 30]. Swaminathan (2003) и Jahnen-Dechent (2012) нормальными границами сывороточной концентрации магния считают 0,7--1,1 ммоль/л [9, 21]. Мы многократно определяли концентрацию магния в плазме крови фотометрическим методом с ксилидиловым синим как у пациентов в состоянии шока на фоне политравмы, после выведения их из шока, при достижении состояния компенсации, так и у здоровых добровольцев, и склоняемся к мнению, что наиболее реальным показателем нормального содержания магния в плазме крови является 0,7--1,1 ммоль/л [30]. Но наиболее часто в норме концентрация магния в плазме, если не проводится магнезиальная терапия, находится в очень узких пределах: от 0,7 до 0,9 ммоль/л.
Термины «гипомагниемия» и «дефицит магния» обычно используются как синонимы. Однако значительная гипомагниегистия может иметь место при нормальных концентрациях магния в сыворотке, и может встречаться значительная гипомагниемия без общего дефицита магния в организме. Гипомагниемия более распространена, чем предполагалось ранее. Распространенность гипомагниемии колеблется от 7 до 11 % у пациентов в стационаре. У пациентов с другими электролитными нарушениями гипомагниемия встречается чаще: около 40 % у пациентов с гипокалиемией, 30 % у пациентов с гипофосфатеми- ей, 23 % у пациентов с гипонатриемией и 22--32 % у пациентов с гипокальциемией. Распространенность гипомагниемии у пациентов, находящихся в критических состояниях, еще выше -- от 20 до 65 %. Гипомагниемия у пациентов отделений интенсивной терапии ассоциируется с повышенным уровнем летальности. Гипомагниемию часто не выявляют. Измерение концентрации магния в сыворотке крови в 1033 пробах, полученных для определения электролитов, показало наличие гипомагниемии более чем у 53 % пациентов [21, 32, 33]. В связи с тем что гипомагниемия очень часто ассоциирована с тяжелым стрессом и множеством заболеваний, течение которых отягощается при дефиците магния в организме, мы считаем, что в практике интенсивной терапии активное введение магния в организм следует проводить уже при его концентрации в плазме крови меньше 0,75 ммоль/л. И это не источник полипрагмазии, поскольку многие специалисты в области интенсивной терапии считают недостаточным уровень общего сывороточного магния, не достигающий 0,85 ммоль/л [34, 35]. В европейском исследовании дефицит магния определялся клинически и сравнивался с концентрацией магния в сыворотке. Было обнаружено, что среди лиц с уровнем магния в сыворотке крови 0,7 ммоль/л у 90 % был клинический дефицит магния; при уровне магния 0,75 ммоль/л клинический дефицит магния имел место у 50 % больных. При пороговом уровне 0,8 ммоль/л 10 % пациентов имели клинический дефицит магния, а при пороговом значении 0,9 ммоль/л -- только 1 % пациентов [36, 37].