По современным представлениям патогенность синегнойной палочки детерминирована способностью к продукции комплекса экзопродуктов - токсинов, энзимов, пигментов. Для P.aeruginosa характерны такие признаки как: слегка изогнутая палочка с закругленными концами, спор не образует, капсулы не имеет, но продуцирует слизь, которая тонким слоем окружает микробную клетку. P.aeruginosa устойчива к ультрафиолетовому излучению, а также к антисептикам, традиционно применяемым в хирургии. В пыли больничных палат сохраняется 2 недели, в кусочках ожоговых корочек - до 8 недель [Пыж, Никандрова, 2001].
Синегнойная палочка отличается высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам, она обладает чувствительностью лишь к немногим антибиотикам. Это особенность P.aeruginosa обуславливает большую устойчивость вызываемых инфекций к антимикробной терапии [Воропаева, 1983].
Воспалительный процесс палочка может вызывать
как в монокультуре, так и в ассоциациях с другими микробами. Нередки случаи,
когда в результате успешного лечения гнойных осложнений стафилококковой
этиологии место стафилококка занимает синегнойная палочка, знаменуя тем самым
так называемую «смену видов», что вызывает коррекцию антимикробной терапии. У
больных пораженных синегнойной палочкой, гной и марлевые повязки окрашиваются в
сине-зеленый цвет за счет пигмента пиоцианина, что в ряде случаев, например,
при утилизации отходов служит полезным идентификационным признаком [Щербо,
2000].
1.2.4 Эшерихии
Из двух видов этого рода эпидемический значимым является E.coli. Следует отметить её возрастающую роль в этиологии ГСИ, что обусловлено природной устойчивостью E.coli ко многим антибиотикам и очень быстрым распространением приобретённой устойчивости. Кишечная палочка может вызывать эшеризиозы, проявляющиеся практический во всех органах и тканях, но особенно превалируют ГСИ мочевыводящих и желчных путей, перитонит, послеоперационные нагноения ран. Возможны менингит, отит, послеродовой сепсис и др. [Рыбальченко, 2003].
Эшерихии имеют О -, К -, и Н-антигены.
Определенные серогруппы E.coli
способны вызывать как различные, включая внутрибольничные, заболевания
человека, так и преимущественно поражать определенные возрастные группы.
Отдельные серотипы E.coli,
например, О 157:Н7, выделяющие шигеллоподобный токсин и вызывающий патологии. В
стационарах, родовспомогательных домах, детских больницах и имеют специальные
профилактики этой формы заболевания, которое характеризуется кровавым поносом,
спазмами в области живота с небольшим повышением температуры, судороги,
припадки. Могут даже вызывать почечную блокаду, которая требуют гемодиализа.
Летальность при обычном течении болезни составляет 1-2%, а при почечной блокаде
3-5%[Медицинская микробиология, 2006].
.2.5 Бактерий группы Клебсиелла-Энтеробактер-Серрация (КЭС)
К роду Klebsiella относится несколько видов, среди которых как возбудители ВБИ имеют наибольшее значение следующие виды: Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serrattia marcescens. Морфологически все они представляют собой грамотрицательные, неспоровые палочки, которые нередко, как «колиформные» бактерии. Эти условно-патогенные микроорганизмы нередко обнаруживаются в составе нормальной микрофлоры человека, обладают высокой природной устойчивостью к повреждающим факторам среды, включая медикаментозные протимикробные воздействия. Среди них все чаще встречается полирезистентные штаммы с приобретенной устойчивостью, способные вызвать различные формы ВБИ: нагноение ран, послеоперационную пневмонию, инфекции мочевыводящих путей [Зиневич, Колуканов,1989].
Особенно часто осложнения «колиморфной природы могут формироваться у ослабленных больных, пациентов с иммунодефицитами. В этих случаях, особенно у детей, нередки менингиты, мастоидиты и другие осложнения.
K.pneumoniaе, ранее известная как, возбудитель заболеваний дыхательной системы, в настоящее время часто является причиной ВБИ, протекающих с поражением дыхательных и мочевыводящих путей. Для K.pneumoniae характерными являются образование слизистых колоний, широкие полисахаридные капсулы и отсутствие подвижности [Воробьев, Кривошеин, 2003].
Основными факторами патогенности клебсиелл являются К - антиген, подавляющий фагоцитоз и эндотоксин. Помимо них, K.pneumoniae может продуцировать термолабильный энтеротоксин - белок, по механизму действия подобный токсину энтеротоксигенной кишечной палочки. Клебсиеллы обладают выраженными адгезивными свойствами.
Благодаря наличию капсулы клебсиеллы устойчивы в окружающей среде, длительное время сохраняются в почве, воде, помещениях. Чувствительны к кипячению и дезинфектантам. K.pneumoniae входит в состав факультативной микрофлоры кишечника, верхних дыхательных путей, влагалища. Обнаруживается на слизистых оболочках [Медицинская микробиология, 2011].
Клебсиеллёз является чаще всего ВБИ. Источником служит больной человек и бактерионоситель. Возможно как экзогенное, так и эндогенное заражение. Наиболее частые пути передачи - пищевой, воздушно-капельный и контактно-бытовой. В последние годы частота клебсиеллёзов возросла, одна из причин этого - повышение патогенности возбудителя в связи со снижением резистентности организма человека. Следует отметить высокую степень резистентности клебсиелл к различным антибиотикам [Коротяев, Бабичев, 2008].
Вирулентность K.pneumoniae обусловлено их адгезией связанной с капсульным полисахаридом, пилями и белком наружной мембраны, размножением и колонизацией энтероцитов. Капсула защищает от фагоцитов. При разрушении бактериальных клеток освобождается эндотоксин [Борисов, 2005].
Кроме того секретирует термостабильный
энтеротоксин усиливающий выпот жидкости в просвет кишки, что играет
существенную роль в патогенезе. Оказывает действие и мембранотоксин с
гемолитической активностью. У некоторых имеются такие ферменты как ДНКаза,
нейраминидаза, фосфатаза [Микробиология, вирусология и иммунологи, 2010].
.2.6 Бактерии рода Acinetobacter
Данный род включает 6 видов, из которых наибольшую роль в этиологии ВБИ играют A.baumannii, и A.haemolyticus. Грамотрицательные палочки, как правило, короткие и округлые, размеры в логарифмической фазе роста составляют 1,0-1,5 на 1,5-2,5 мкм. В стационарной фазе роста приобретают преимущественно форму кокков, располагающихся парами или в виде коротких цепочек. Спор не образуют, жгутиков не имеют. Все виды резистентный к пенициллину. Являются свободноживущими сапрофитами, распространены повсеместно. Могут быть причиной многих инфекционных процессов, включая менингиты. Патогенность низкая, но могут играть важную клиническую роль для людей с ослабленной природной резистентностью.
В клинике факультетской хирургии лечебного факультета РГМУ им. Пирогова проводились исследования по проблеме нозокомиальных инфекций в хирургии. За последние годы был отмечен отчетливый рост частоты нозокомиальных инфекций, вызванных микроорганизмами рода Acinetobacter. Естественной средой обитания Acinetobacter spp является почва и вода. Микроорганизмы рода Acinetobacter входящие в состав микрофлоры кожи здоровых лиц, желудочно-кишечного и урогенитального трактов и относятся к малопатогенным микроорганизмам. Acinetobacter spp. отличается устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам [Проблемные госпитальные микроорганизмы, 2008].
Клиническое значение ацинетобактерий при гнойно-воспалительных заболеваниях кожи и мягких тканей изучено недостаточно. Acinetobacter spp. изолирован от 546 пациентов отделения гнойной хирургии городской клинической больницы №15 им. О.Ф.Филатова с 2000 по 2007 гг. За период наблюдений отмечено увеличение доли ацинетобактерий в пейзаже микрофлоры гнойных ран. 85% изолированных штаммов приходилось на A.baumannii. Инфицирование ран отмечалось на 9 сутки после госпитализации. Основным фактором риска присоединения ацинетобактерий явились фоновые заболевания, приводящие к трофическим нарушениям у 80% пациентов. У 54% пациентов наличие ацинетобактерий в ране не влияло на течение раневой инфекции, а у 46% гнойно-воспалительное заболевание прогрессировало. У 9% ацинетобактерии изолированы в монокультуре. Остальные в ассоциациях, чаще с S.aureus (41%). A baumannii более резистентный, чем другие Acinetobacter spp. Наиболее активны в отношении A.baumannii нетилмицин (80%), имипенем (94%), меропенем (64%). Малоактивны амикацин, гентамицин (30-35%), цефоперазон-сульбактам (50%). Цефалоспорины и ципрофлоксацин неактивны в отношении A.baumannii [Жилина, Миронов, Поликарпова, 2007].
По литературным данным лидирующие позиции в
этиологии гнойно - септических осложнении занимают неферментирующие
грамнегативные бактерии (НГБ) - P.aeruginosa,
A.baumannii
и
Acinetobacter
spp. Отмечена
выраженная тенденция к увеличению их доли в развитии данной патологии при
снижении этиологической роли стафилококков. Мониторинг выявил высокий уровень
резистентности к антибиотикам (меропенему, имипенему, цефепиму, цефтазидиму) P.aeruginosa,
а все штаммы A.baumannii
устойчивы к гентамицину и цефтазидиму [Туркутюков, Ибрагимова, Шмагунова,
2013].
2. Материал и методы исследования
Работа проводилась с 10 июня по 27 июля года в бактериологической лаборатории Краевой клинической больницы №1 им. проф. С.В. Очаповского.
Все исследования проведены согласно методикам,
утвержденным Приказами Минздрава РФ: № 535 от 22 апреля 1985г. И №720 от 31
июня 1978г. № 720 от 31 июля 1978 г. «Об улучшении медицинской помощи больным с
гнойными хирургическими заболеваниями и усилений мероприятий по борьбе с
внутрибольничными инфекциями».
2.1 Объекты исследования
Объектами исследования явились материалы от больных отделения гнойной хирургии и ожогового отделения ККБ: асцитическая жидкость, гной, раневое отделяемое, отделяемое дренажа, отделяемое свищей, перикардиальная жидкость, перитониальная жидкость, пунктаты, содержимое абсцессов, содержимое брюшной полости, содержимое кист.
Все данные объекты исследования объединяются в общую группу «Отделяемое открытых инфицированных ран».
Всего за время работы в бактериологической
лаборатории на исследование было взято 1123 проб материала (172 проб в
отделении гнойной хирургии, 465 проб в реанимации гнойной хирургии и 304 проб в
ожоговом отделении, 182 пробы в реанимации ожогового отделения).
2.2 Среды для культивирования микроорганизмов
Все объекты от больных, высевались на специальные среды для дальнейшего исследования. Использовались следующие среды:
МПА - готовая стандартная среда производства Махачкалинской биофабрики.
Среда Эндо - готовили из готового сухого порошка (г. Махачкала) по инструкций, указанной на упаковке. Горячую среду разливали в стерильные чашки Петри и оставляли до застывания на поверхности стола в стерильном боксе. Срок годности готовой среды Эндо - не более трех дней в темном месте или в холодильнике. Данная среда применяется для обнаружения бактерий группы кишечной палочки.
Среда Сабуро - применяется для культивирования, поддержания и подроста дрожжеподобных грибов. Срок приготовления: 45г готовой смеси (производитель - фирма Bio-Merieux, Франция) растворяли в 1 л дистиллированной воды, доводили до кипения, разливали в стерильные во флаконы по 200-400 мл и автоклавировали при температуре выше 100 градусов 15 мин.
Сердечно-мозговой бульон - среда обогащения для различных микроорганизмов. Готовили следующим образом: готовую сухую смесь (производитель - фирма Bio-Merieux, Франция) в количестве 37 г растворяли в 1 л дистиллированной воды, кипятили 2 мин, затем разливали в стерильные флаконы по 50 мл и автоклавировали 15 мин при температуре 120 градусов.
Желточно-солевой агар (ЖСА)- данная среда используется для обнаружения стафилококков. Готовили следующим образом: расплавляли 1 л МПА, растворяли в нем 95г хлорида натрия (NaCl), охлаждали до 45-50 градусов, добавляли 20% желточной взвеси (асептический извлеченный из яйца желток взбалтывали с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Агар тщательно смешивали с желточной взвесью, разливали по 20 мл в чашки Петри.
Кровяной агар - универсальная питательная среда для различных микроорганизмов, основой которой является сухой питательный агар. Готовили следующим образом: готовили 2% агара (pH 7,4-7,6), к расплавленному и охлажденному до 45 градусов агару, соблюдая правила асептики, добавляли 5 % питательную среду (дефибринированную баранью, лошадиную или кроличью кровь; цитратную или дефибринированную кровь человека без антибактериальных препаратов). Смесь тщательно перемешивали, не допуская образования пены, разливали в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате, слоем 3-4 мм. Среду хранят не более двух недель в целлофановых мешках при температуре 4-6 градусов.
Кроме выше перечисленных сред для идентификации различных групп микроорганизмов применялись следующие среды:
Среда Хью-Лейфсона (идентификация стафилококков, псевдомонад). К1 л дистиллированной воды добавляли 2 г пептона, 5 г хлорида натрия (NaCl), 3 г агар-агара; подогревали смесь до растворения ингредиентов, подщелачивали 20% раствором гидроксида натрия (NaOH) до pH 7,4-7,5, доводили объем среды до первоначального и добавляли 3 мл 1 % водного раствора бромтимолового синего; стерилизовали при 0,5 атм. 20 мин.
Среда Олькеницкого (идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae): к 100 мл дистиллированной воды добавляли 2,5 г сухого питательного агара, 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,03 г тиосульфата натрия, 0,04 мл 0,4 % водного раствора фенолового красного; все тщательно перемешивали, устанавливали pH 7,2-7,4, разливали по пробиркам, стерилизовали текучим паром по 20 мин 3 дня подряд; затем среду скашивали, оставляя столбик высотой 5 см.
Среда Кларка, среда Симмонса - питательные среды для изучения ферментации полисахаридов бактериями семейства Enterobacteriaceae. Готовили из готовых сухих смесей согласно прописям на упаковках 9 (производитель - НПО «Питательные среды», г. Махачкала, Россия).
Среда КингА (идентификация псевдомонад) - сухая коммерческая среда (производитель - НИИМП, г. Ростов-на-Дону, Россия).
Среда для определения фосфатазы (используется
при идентификации бактерий рода Staphylococcus).
Готовили из готовой сухой смеси согласно прописям на упаковке (производитель -
НПО «Питательные среды», г. Махачкала, Россия).
.3 Выделение возбудителей из объектов внешней среды
Взятие исследуемого материала с поверхности
различных объектов вели методом смывов при помощи стерильного ватного тампона
на палочке или марлевой салфеткой. При контроле предметов с большой
поверхностью смывы проводили в нескольких местах исследуемого предмета.
Отобранные пробы засевали на чашки Петри с ЖСА, 0,5 мл смывной жидкости
засевали в 5 мл бульона с 6,5 % хлоридом натрия для выделения S.aureus.
Затем инкубировали при температуре 37 градусов 18-24 часа. При наличии
подозрительных колоний готовили мазки, окрашивали и микроскопировали.
2.4 Методы идентификации микроорганизмов
.4.1 Идентификация бактерий рода Staphylococcus
Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. Для стафилококков характерны золотистые или белые колонии. Подавляющее большинство штаммов золотистого стафилококка и некоторые штаммы S.epidermidis на кровяной среде образуют прозрачную зону гемолиза. В мазках располагаются поодиночке, парами или в виде скоплений. Для идентификации данного рода использовались следующие тесты:
а) Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма сеяли в столбик среды Хью-Лейфсона уколом до дна пробирки, а затем на поверхность агара наливали 1,5 мл стерильного вазелинового масла. Посев инкубировали при 37 градусах. Реакция считается положительной, если происходит желтое окрашивание столбика среды.
б) Определение лецитиназы. Для выделения лецитиназы посевы инкубировали на ЖСА в течение 18-24 часов, а затем еще 18-24 часа. О наличии лецитиназы свидетельствует радужный венчик вокруг колоний.
Определение ферментации маннита в анаэробных условиях. Определение проводили аналогично определению ферментации глюкозы в анаэробных условиях.
в) Реакция плазмокоагуляции. Разведенную плазму кролика в объеме 0,5мл вносим в стерильную пробирку и в ней суспендировали одну петлю агаровой суточной культуры. Инкубируют при 37 градусах. Регистрировали результаты через 1, 2, 4, 18 часов инкубации. При появлении в первые 4 часа инкубации на дне пробирки студнеобразного сгустка, результат считали положительным. При отсутствие плазмогоагуляции в течение 18 часов - отрицательным. При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы одного из двух предварительных тестов исследуемый штамм относили к виду S.aureus. Если штаммы после проделанных исследований не относили к золотистому стафилококку, то проводили дальнейшую идентификацию.