Статья: Энзиматические свойства фактора роста нервов (NGF) и его субъединиц Н.С. Пыжова

Рисунок 2. - Влияние группоспецифических ингибиторов(7 - фенилметилсульфонилфторид, 2 -_р-хлормеркурибензоат, 3 - о-фенантролин, 4 - 8-гидроксихинолин, 5 - ЭДТА) протеиназ (10^-3 М) на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) олигомера фактора роста нервов (а), его Р-(б) и у-(")субъединиц, п = 4

Примечание Здесь и далее статистически достоверные изменения при Р < 0,05.

Следовательно, плазминоген-активаторная способность исследуемых образцов, по-видимому, является обусловленной серин-содержащим активным центром. В случае Р-субъединицы, возможно, имеет место участие или регуляторное действие металл-содержащих сайтов молекулы.

Поскольку активация плазминогена способна реализовываться при участии активных форм кислорода [30, 31], вполне естественно возникал вопрос о возможной взаимосвязи КОБ и его субъединиц с реакциями генерирования и трансформации активных форм кислорода.

Прежде всего, было изучено действие перехватчиков активных форм кислорода на плазминоген-активаторную функцию олигомера фактора роста нервов и его субъединиц.

Оказалось, что плазминоген-активаторная способность 78КОБ, Р- и у-субъединиц подавлялась нитротетразолиевым синим (0,001 М) на 47, 40 и 100% соответственно, но не перехватчиками О ₂^{Л 1} или НО'-радикала ([12, 15, 17], рисунок 3).

То обстоятельство, что олигомер КОБ в ряде случаев менее чувствителен к эффекторам, чем субъединицы - один из моментов, ничной организации ЧОБ, согласно которой Р-субъединица заметно экранирована от растворителя [32].

Дальнейшие исследования опосредованных О ₂^: процессов в действии субъединиц фактора роста нервов на биохемилюмино-метре БХЛ-01 (МП "Универсал", Минск) показали, что в системе "люминол-Н ₂О ₂" внесение Р- и, особенно, у-субъединицы вызывало вспышку хемилюминесценции с последующим затуханием. Такой способности была лишена а-субъединица ([15, 17, 20, 21], рисунок 4).

Рисунок 3. - Влияние перехватчиков активных форм кислорода (10^-3 М, 1 - нитротетразолиевый синий; 2 - адреналин; 3 - манит; 4 - формиат; 5 - азид натрия; 6 - гистидин; 7 - триптофан) на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) олигомера фактора роста нервов (а), его Р-(б) и у-(в)субъединиц

Примечание - п=4; метод лизиса фибриновых пластин; 0,006 М фосфатный буфер рН 7,4; 37 ^оС.

Однако в системах генерирования супероксидного радикала редукция восстановления нитротетразолиевого синего наблюдалась в присутствии всех трех субъединиц: а-, Р- и у- на 55-62, 23-27 и 41-52% соотвест- венно. Причем подавление реакции образования формазана а-субъединицей не отличалось от такового в присутствии у- субъединицы и заметно превышало величину, наблюдавшуюся при внесении в системы Р-субъединицы ([12, 17, 18, 20, 21], таблица 4).

Рисунок 4. - Кинетика затухания хемилюминесценции в системе "люминол-Н 2О 2", вызванной субъединицами фактора роста нервов

Примечание - п = 4; 0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4; содержание в смеси люминола с концентрацией 1,2" 10^-4 М -1,0 м, содержание в смеси Н ₂О ₂ с концентрацией - 3^10^-3 М - 0,1 мл, содержание субъединиц в реакционной смеси - 0,065 мг; 1 - фон; 2 - а-субъединица; 3 - в- субъединица; 4 - у-субъединица; 25 °С.

Таблица 4. - Влияние олигомера 78 КОБ и его субъединиц на восстановление нитротетразолиево- го синего супероксидными радикалами в буферном растворе (п=4)

Примечание - а) 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, конечная концентрация ИАИИ - 5,2"10^-5 М, феназин- метосульфата - 6"10^-6 М, нитротетразолиевого синего - 5,5"10^-5 М; б) 0,052 М пирофосфатный буфер рН 8,3, конечная концентрация аскорбата - 7,6"10^-5 М, феназинметосульфата - 1,1"10^-5 М, нитротетразолиевого синего - 6,7"10^-5 М.

Изложенные материалы в достаточной степени свидетельствуют о том, что плазминоген-активаторная функция в-субъединицы КОБ самостоятельна и не вызвана примесью у-субъединицы. Дополнительным аргументом является действие на плазминогенактиваторную способность пуриновых нуклеотидов ([15, 22], рисунок 5).

Рисунок 5. - Влияние пуриновых нуклеотидов на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) Р-(1) и у-(2)субъединиц фактора роста нервов (п=4; метод лизиса плазминогенсодержащих фибриновых пластин)

Адениловые и гуаниловые нуклеотиды играют важную роль в регуляции протеолиза [33, 34]. Действие пуриновых нуклеотидов на эти субъединицы отличалось от такового на стрептокиназу [33]. Активность обеих субъединиц как и стрептокиназы резко - на 70100% - угнеталась АТР. Но в отличие от стрептокиназы, активаторная функция которой подавлялась 3',5'-АМР, но не АМР, ADP и GTP [34], активность обеих субъединиц не изменялась при добавлении 3',5'-АМР (не показано), умеренно - на 18-40% - снижалась в присутствии ADP и на 40% возрастала в присутствии АМР. Наконец, активность Р- субъединицы и у-субъединицы угнеталась при добавлении GTP на 100 и 40% соответственно. Это дает основание считать, что плазминоген-активаторная функция Р- субъединицы самостоятельна и не вызвана примесью у-субъединицы.

В дальнейшем уже в 2010-2011 годы было установлено, что фактор роста нервов способен связывать 1-2 молекулы АТР в гепарин- связывающем домене молекулы NGF и именно 8N1ATP- NGF комплекс наделен нейропротекторной активностью [35, 36].

Как мы уже указывали во введении, принято считать, что истинной протеолитичесокй активности Р-субъединица лишена. В наших экспериментах методом фибриновых пластин с инактивированным плазминогеном, а также методом лизиса казеина и гемоглобина в тонком слое агарового геля было также установлено, что ни фибрин, ни казеин, ни гемоглобин олигомер КОБ и его субъединицы не расщепляли (не показано). Тем не менее, удалось подобрать белок-субстрат, который вполне демонстративно расщепляли уи Р-субъединицы. Им оказался протаминсульфат [24 и др.]. При этом протеолитическая активность Р-субъединицы в четыре-пять раз уступала таковой у-субъединицы (таблица 5).

Таблица 5. - Расщепление протамин-сульфата субъединицами КОБ в тонком слое агарового геля ("=4)

Примечание - Метод лизиса белка-субстрата в тонком слое агарового геля; концентрация агара - 1%, протамин-сульфата - 2%, 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, объем образцов субъединиц - 15 мкл, инкубация при 37 °С 24 часа пластину 1 %-ого агара "БИео", приготовленную на 0,06 М фосфатном буфер рН 7,6.

Это дало косвенное подтверждение материалам рисунка 4 и допущению, что Р-субъединица фактора роста нервов при определенных условиях способна расщеплять асубъединицу.

Ингибиторный анализ показал, что протеолитическая активность Р-субъединицы заметно угнеталась фенилметилсульфонилфторидом и умеренно подавлялась офенантролином (рисунок 6).

Рисунок 6. - Влияние группоспецифических ингибиторов протеиназ и комплексонов (10^-3 М, 1 - фенилметилсульфонилфторид;

2 -р-хлормеркурибензоат; 3 - о-фенантролин, 4 - ЭДТА) на расщепление протамин-сульфата (% к контролю) в тонком слое агарового геля и р-субъединицей фактора роста нервов

Примечание - п=3; метод лизиса белок-агаровых пластин; 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4; 37 ^оС.

Учитывая имеющееся в литературе мнение о зимогенном характере а-субъедицы [7], логична была попытка вызвать активацию этого "зимогена" при воздействиях, активирующих другие зимогены: плазминоген, трипсиноген, химотрипсиноген, пепсиноген - источниками активных форм кислорода прежде всего - супероксидного радикала [31,37,38].

Аликвоты а-субъединицы КОБ обрабатывали ионами Бе ²+ или Бе ³+ в конечной концентрации 10^-7-10^-2 М, системами генерирования активных форм кислорода - Си 80₄+КЛБН+рибофлавин, СиС 1₂+рибофлавин+аскорбат, Бе 80₄+рибофлавин+аскорбат, ТЕ-МЕД+рибофлавин, феназинметосуль-фат+КЛБН, Н ₂О ₂ в конечной концентрации 0,1-3,0 М, а также стрептокиназой. Методами лизиса фибриновых или протаминагаровых пластин не было зафиксировано расщепление белков [12,22].

Следовательно, если а-субъединица и представляет собой зимоген, он активируется путем, отличным от зимогенов других протеиназ.

Еще одной неожиданностью было установление у субъединиц КОБ нуклеазной активности.

Методом лизиса ДНК селезенки или тРНК дрожжей в тонком агаровом слое с последующей визуализацией зон лизиса обработкой 2 н НС 10₄ (как подробно описано ранее [13]) установлена эндонуклеазная активность при рН 7.4 по обоим субстратам у всех трех субъединиц (таблица 6 и [14, 17, 20 и др.], таблица 6).

Таблица 6. - Расщепление ДНК и РНК в тонком слое агарового геля субъединицами КОБ (и=3, инкубация при 37°С, 24 часа)

Примечание - 0,05 М трис-НС 1 буфер рН 7,6, содержащий 5 мМ MgS0₄, 5 мМ СаС 1₂ и 1 мМ ЭДТА; концентрация агар-агара - 1,5%, концентрация ДНК - 20 мг/10 мл, концентрация тРНК - 30 мг/10 мл; фиксация - 1 н НС 10₄.

Рисунок 7. - Зависимость расщепления ДНК (а) и РНК (б) в тонком слое агарового геля а-(1), Р-(2) и у-(3)субъединицами NGF

Примечание - n=4; 0,05 трисHCl буфер pH, концентрация агара - 1.5%, содержащая ДНК селезенки в пластине - 20 мг или тРНК дрожжей - 30 мг; инкубация при 37°С, 24 часа [24].

Концентрационная зависимость активности показала, что обе эндонуклеазные активности проявлялись у р-субъединицы при более низких ее концентрациях, чем у других субъединиц (рисунок 7). Однако эта зависимость у р-субъединицы в обоих случаях имела вид кривой с насыщением, тогда как активность аи у-субъединиц в широком диапазоне концентраций изменялась практически линейно (рисунок 7 и [17, 21]).

Можно было думать, что нуклеазная активность а-субъединицы была вызвана возможной примесью у-субъединицы. Однако, как показали исследования действия традиционных эффекторов эндонуклеаз, например, ДНК-азная активность а-субъединицы в 0,06М фосфатном буфере подавлялась Са ²⁺, Со ²+, Мп ²⁺, Си ²+ и аргинином в концентрации 10^-3 М на 50-65%, тогда как данные эффекторы (за исключением Си ²+) на таковую активность у-субъединицы практически влияния не оказали, а под действием катионов Си ²+ ее активность возрастала [14,15,17,20].

Определение АТФ-азной активности уили а-субъединиц в реакционной смеси, включающей 0,05 М трис-НС 1 буфер рН 7,4, 0,02 М КС 1, 0,003 МеС 1₂ + 0,003 М СаС 1₂ + 0,003 М КаНС 0₃ и АТР0,006 М, показало отсутствие освобождения неорганического ортофосфата в реакции с молибдатом аммония.

Заключение

Итак, изложенные результаты показывают, что в период 2000-2005 годы у олигомера КОБ и его субъединиц нами был обнаружен ряд ранее неизвестных функциональных свойств. Это обстоятельство позволяет по-новому взглянуть на структурно функциональную специфику данного регуляторного белка и на пути реализации его биологического действия.

Прежде всего, важным моментом является наличие у Р-субъединицы плазминогенактиваторной способности, а у Ри усубъединиц - прямой протеолитической активности в отношении основного белка - протамина. Ингибиторный анализ свидетельствует о "сериновой" природе этой активности. Причем, судя по всему, в молекуле Рсубъединицы присутствуют функционально значимые металл-содержащие сайты. Это вызывает также логичный вопрос о способности данных субъединиц расщеплять и гистоны.

Все три субъединицы наделены супероксид-конвергирующий способностью, но только Ри у-субъединицы способны расщеплять Н 2О 2 с генерированием активных форм кислорода. Наличие О ₂^: - конвергирующей способности как и генерирование активных форм кислорода при расщеплении гидропероксида дают основание полагать наличие в молекулах субъединиц металлов с переменной валентностью - не 2п.